膠體金免疫層析法快速檢測牛奶、奶粉、飼料中的三聚氰胺

摘要：建立了快速檢測牛奶、奶粉、飼料樣品中三聚氰胺的膠體金免疫層析分析法。將三聚氰胺進行分子修飾得到兩種衍生物，分別與牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）相連制得免疫原和包被抗原。運用雜交瘤抗體制備技術得到抗三聚氰胺的單克隆抗體（mAb）。利用檸檬酸三鈉還原法制得平均粒徑18 nm的膠體金，將膠體金與抗三聚氰胺單克隆抗體相連，所形成的金標抗體（AumAb）包被在膠體金墊上，包被抗原和羊抗鼠二抗分別包被在硝酸纖維素膜（NC）上作為檢測線（T線）和質控線（C線）。將膠金墊、NC膜、樣品墊和吸水紙組裝成免疫層析快速檢測試劑條。將標準溶液（或待測液） 滴加到樣品墊上，10 min后可在NC膜C線和T線位置上用肉眼觀察到膠體金的顏色（紅色） ，通過比對顏色的深淺判斷樣品中三聚氰胺的含量。結果表明，三聚氰胺的檢出限為10 μg/L；選用了其它10種物質對免疫層析試劑條進行了特異性實驗，免疫層析試劑條與2氯4，6二氨基1，3，5三嗪和環丙氨嗪的交叉反應率約為1%，與其它8種物質沒有交叉反應；加標樣品用免疫層析試劑條和酶聯免疫吸附分析法（ELISA）同時檢查，結果一致。本方法適用于牛奶、奶粉、飼料樣品中三聚氰胺的現場快速檢測。

關鍵詞：三聚氰胺； 單克隆抗體； 膠體金； 免疫層析法

1引言

三聚氰胺（Melamine， 圖1a），化學名為2，4，6三氨基1，3，5三嗪，是一種重要的氮雜環有機化工原料，主要用作生產三聚氰胺甲醛樹脂的原料，這種樹脂被廣泛運用于木材、塑料、造紙、紡織、皮革等行業；三聚氰胺還可以作阻燃劑、減水劑、甲醛清潔劑等[1]。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，而常規的“凱氏定氮法”檢測食品或飼料中蛋白質含量時不能排除這類“偽蛋白氮”的干擾，因而一些不法分子為降低成本， 在牛奶、奶粉和飼料添加這種非食品性化工原料，以提高其產品中的蛋白質含量。2008年10月，我國制定了乳品中三聚氰胺管理限量值，嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg；含乳15%以上的其它食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg。

目前，檢測三聚氰胺的主要方法有氣相色譜質譜聯用法（GCMS）[2，3]、高效液相色譜法（HPLC）[4～6]、液相色譜質譜聯用法（LCMS）[7～9]，這些方法雖然準確度高，但樣品預處理復雜、設備昂貴，檢測費用高。近年來，酶聯免疫吸附法[10～12]以及膠體免疫層析試劑條[13，14]等已用于三聚氰胺的檢測，但仍存在靈敏度不夠高或特異性不夠強等不足。本研究對三聚氰胺的分子結構進行了較合理的修飾，合成了兩種三聚氰胺衍生物，并分別與牛血清白蛋白和雞卵清白蛋白相連制得免疫原和包被抗原。利用雜交瘤抗體制備技術得到抗三聚氰胺的單克隆抗體，以所制得的抗體為基礎，建立了測定牛奶、奶粉、飼料中三聚氰胺的膠體金免疫層析法。

2.2實驗方法

2.2.1三聚氰胺衍生物的制備本研究對三聚氰胺的分子結構進行了較合理的修飾，制備了兩種三聚氰胺衍生物。衍生物1（分子結構如圖1b）：稱取CAAT加入反應瓶，用無水甲醇溶解，再加入對氨基苯甲酸（溶于KOH無水甲醇中）；反應回流5～12 h，直到CAAT反應完全；反應混合物過濾，并用無水乙醇和蒸餾水各洗3次，得到白色粗產物；再用甲醇二氯甲烷過柱，得到純品。衍生物2（分子結構如圖1c 所示）的制備過程與制備衍生物1相同，但溶劑為無水乙醇，衍生試劑為3巰基丙酸。