絲狀真菌產(chǎn)凝乳酶生物特性的研究

摘 要：微小毛霉var Linta。是最早發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)凝乳酶絲狀真菌，且其蛋白酶活力較低；米黑毛霉NR RL3420高產(chǎn)凝乳酶菌株在1971年也被報(bào)道，隨后人們還發(fā)現(xiàn)黑曲霉等菌株產(chǎn)蛋白酶也有凝乳酶的性質(zhì)。由于利用絲狀真菌生產(chǎn)凝乳酶具有C/P值（凝乳酶活力/蛋白酶活力）高且不易受雜菌污染等優(yōu)勢(shì)，因此本章對(duì)絲狀真菌在。0-5天發(fā)酵周期中各因素的動(dòng)態(tài)特性進(jìn)行研究，做了系統(tǒng)的比較試驗(yàn)。探討不同發(fā)酵時(shí)間下菌株種類、生物量、發(fā)酵液蛋白含量、發(fā)酵液pH值以及凝乳酶活和C/P值的變化規(guī)律。

關(guān)鍵詞：真菌；酶；溫度

中圖分類號(hào)：Q81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

一、材料與方法

1.1菌株

（1）兩株微小毛霉（Mucor Pusillus）菌購(gòu)買自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，編號(hào)分別為CGMCC 3.3445 和CGMCC 3.204；

（2）米黑毛霉（Mucor miehei）ATCC 16457；

1.2試劑

脫脂奶粉為新西蘭進(jìn)口；考馬斯亮藍(lán)、福林-酚以及牛血清蛋白（BSA）試劑購(gòu)自Sigma；葡萄糖、蛋白陳、瓊脂、蔗糖等試劑均為生化純或分析純。

1.3培養(yǎng)基

（1）PDA固體培養(yǎng)基：稱取去皮的馬鈴薯200 g并切成塊狀，1000mL沸水煮30 min后過(guò)濾濾渣；保存過(guò)濾液定容至1L后，趁熱加入20 g蔗糖，攪拌均勻至全部溶解，分裝到250 mL錐形瓶中，每瓶加入量不超過(guò)100 mL；慢慢加入20g瓊脂，迅速攪拌使其溶解，并繼續(xù)加熱至溶液澄清，115℃滅菌30 min；在紫外超凈工作臺(tái)中，按無(wú)菌操作方法趁熱倒平板（或斜面），冷卻凝固后接種或放入4℃冰箱保藏待用。

（2）沙氏固體培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基）：葡萄糖4%，蛋白陳1% ，瓊脂2%。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：配置各成分濃度分別為蔗糖50 g·L-1、玉米漿40 g·L-1、胰蛋白陳0.5 g·L-1、Na2HPO4-12H2O4 g·L-1、Na2CO3 1 g·L-1以及CaC12 1 g·L-1，每250 mL錐形瓶中裝液量為50 mL，自然pH；115℃滅菌30 min待用。

1.4菌株的活化及發(fā)酵培養(yǎng)

（1）菌株的活化：取保存在4℃的PDA斜面菌株，無(wú)菌條件下，劃線接種到新鮮沙氏斜面培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2天。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)：挑取兩環(huán)已活化的孢子在發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，160 rpm搖瓶培養(yǎng)5天，分別測(cè)定菌株的生物量、發(fā)酵液的pH、蛋白含量、凝乳酶活力以及蛋白酶活力，每隔24h記錄一次。

二、結(jié)果與討論

2.1低濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用Bradford法測(cè)定發(fā)酵粗酶液蛋白含量。

由低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白含量計(jì)算公式：y=144.85x........................（式2-1）

R2為0.9917

其中y-蛋白含量（μg/mL） ；

X-595nm下吸光度值。

2.2發(fā)酵液pH與凝乳酶活力的變化

產(chǎn)凝乳酶活力大小順序?yàn)槊缀诿笰TCC 16457（21 SU/mL）>微小毛霉CGMCC 3.3445 （12 SU/mL）>微小毛霉CGMCC 3.204（11.7 SU/mL）。由于米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶活力明顯偏高，確定作為生產(chǎn)菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

發(fā)酵周期，發(fā)酵液的pH值呈不斷下降的趨勢(shì)，之后趨十穩(wěn)定。其中微小毛霉CGMCC 3.3445發(fā)酵72 h后pH穩(wěn)定在4左右，米黑毛霉最終pH為2.5，微小毛霉為CGMCC 3.204為3.3。

2.3不同菌株凝乳酶合成曲線

不同絲狀菌株凝乳酶合成模式相同，為滯后合成型。凝乳酶合成時(shí)間為菌株生長(zhǎng)處于平衡期后，到生物量趨十穩(wěn)定后一段時(shí)間。其中，微小毛霉CGMCC 3.204滯后期達(dá)到72 h，其他兩種菌株均為48 h左右后凝乳酶開(kāi)始合成。

凝乳酶的滯后合成說(shuō)明絲狀真菌產(chǎn)凝乳酶受阻遏物影響較大，當(dāng)生長(zhǎng)代謝處十平衡期，阻遏物被分解代謝完全，凝乳酶才開(kāi)始合成。

2.4發(fā)酵過(guò)程蛋白含量的變化

不同菌株產(chǎn)蛋白含量隨時(shí)間變化差異較大，其中米黑毛霉蛋白含量較高，兩株微小毛霉胞外蛋白含量較低。發(fā)酵120 h，米黑毛霉蛋白含量為0.05 g/L，凝乳酶活力為166 SU/mL；微小毛霉CGMCC 3.3445為0.02 g/L，凝乳酶活力為12 SU/mL；說(shuō)明凝乳酶活力隨蛋白含量的升高而升高，可能當(dāng)生物量趨十穩(wěn)定后，凝乳酶活力和胞外蛋白含量成正比。

米黑毛霉的粗發(fā)酵酶液蛋白含量隨時(shí)間變化較大，發(fā)酵 48-96 h，發(fā)酵液蛋白含量顯著升高，96 h后隨著蛋白含量的顯著下降，發(fā)酵液凝乳酶活性也顯著下降，可能是受pH影響，導(dǎo)致蛋白不穩(wěn)定而降解，使胞外蛋白含量和凝乳酶活性都急劇降低。

結(jié)語(yǔ)

（1）利用三株絲狀真菌米黑毛霉（M.miehei）ATCC 16457，微小毛霉（M. pusillus）CGMCC 3.3445，微小毛霉（M. pusillus）CGMCC 3.204發(fā)酵，凝乳酶均為滯后合成型。搖瓶發(fā)酵凝乳酶主要合成時(shí)間在發(fā)酵48-96 h。

（2）絲狀真菌產(chǎn)凝乳酶活力大小順序?yàn)槊缀诿笰TCC 16457最高，發(fā)酵96 h，凝乳酶活力達(dá)到21 SU/mL；確定米黑毛霉ATCC 16457作為下一步誘變育種的菌株。

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