無創性產前診斷技術應用于21-三體綜合征篩查的進展

周奮翮 孫路明

（同濟大學附屬第一婦嬰保健院 上海 200040）

染色體非整倍體異常是一類常見的胎兒遺傳性疾病，發病率占出生胎兒的1/300。最常見的非整倍體異常即為21-三體綜合征（唐氏綜合征），其發生率約為1/800。人們通過不同的篩查方法，希望在孕期能夠盡可能的篩查出該病的高危人群。目前常用的篩查方法為早孕期和中孕期篩查，即控制檢出率達到90.0%，假陽性率在2.0%～5.0%的情況下，多采取孕婦年齡、胎兒超聲檢查結合母體血清學指標綜合計算得出相應的結果，其結果分為低危和高危[1]。對于高危人群，往往采取絨毛活檢或者羊水穿刺取樣，進行胎兒染色體核型分析獲得確切的結果明確診斷。但無論何種方法，侵入性診斷始終存在約0.5%～1.0%的胎兒丟失率。

隨著通過母體外周血獲取胎兒細胞方法的逐漸成熟，越來越多的產科醫院開始嘗試無創的產前診斷方法。自1990年以來，這項技術被人們不斷探索并取得長足進展，為遺傳性疾病的高危人群提供了一種安全的產前診斷方法。該技術本身也存在一定的問題亟待解決，因此這項技術仍然在不斷的完善中，暫未大規模的應用于臨床。本文結合最近一段時間文獻相關報道的復習，對無創性產前診斷技術應用于篩查21-三體綜合征的進展進行討論。

1 無創性產前診斷技術實驗室檢測方法的進展

1.1 利用孕婦外周血中胎兒細胞診斷胎兒非整倍體異常

由于孕婦外周血中發現了胎兒細胞，故人們聯想到利用孕婦外周血中胎兒細胞診斷胎兒非整倍體異常。如果能夠獲得完整的胎兒基因組DNA，則可以進行完整的胎兒染色體核型分析，從理論上可以作出這樣的推斷。困難在于，外周血中發現的胎兒細胞類型多樣，主要有滋養細胞、胎兒有核紅細胞（NRBC）、淋巴細胞和粒細胞等。相對其他細胞來說，NRBC是單核細胞，壽命短且穩定，增殖能力有限，不滯留到下次妊娠。此外，NRBC有明顯的形態學特點和特殊的細胞表面標志物，易于識別，因此被認為是理想的無創傷性產前診斷靶細胞[2]。

影響胎兒細胞應用于臨床診斷的因素，首先是獲得的胎兒細胞數量太少且存在一定的背景干擾。不但有胎源性，也有母源性。因此，在利用NRBC進行無創性產前診斷時，須對分離到的NRBC來源進行鑒定，以保證結果的準確性。起初常用的方法為FISH技術（即原位熒光免疫雜交）。但人們發現采用FISH方法時，大多數細胞難以進行熒光標記，且判讀結果依賴于人工，效率低下，這些因素都影響了孕婦外周血中胎兒NRBC在產前診斷中的應用。現階段提出可能的改進方法為尋找新的特異性標記物或改進胎兒細胞的收集方法。可以設想，如果孕婦外周血中的胎兒細胞能夠培養成功，可以獲得足夠的應用于核型分析的胎兒細胞，再結合改進的FISH技術，如光譜核型分析可能使得非侵入性產前診斷胎兒非整倍體出現突破性進展。

1.2 利用孕婦血漿中游離胎兒DNA檢測胎兒非整倍體異常

有研究發現懷有染色體非整倍體胎兒的孕婦，其血漿或血清中胎兒游離DNA濃度高于懷有正常胎兒的孕婦，但困難的是在孕11～17周，母體的游離DNA占絕對優勢，使用傳統的DNA提取技術和熒光定量聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR)方法難以對胎兒染色體非整倍體異常進行準確診斷。解決這一問題的途徑，一種方法是增加提取的胎兒DNA濃度或抑制母體DNA濃度，減少背景DNA；另一種方法是尋找孕婦外周血中新的胎兒特異性標志物，使之不受高濃度母體背景DNA的影響[3]。近年來表觀遺傳學的研究為這一設想提供了可能，DNA甲基化是最早發現也是最重要的基因表觀修飾方式之一。DNA甲基化是在DNA甲基化轉移酶的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉變為5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化調控了基因的表達但并不改變基因的序列。一般情況下，DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。2002年Poon等[4]利用甲基化特異性PCR方法，不僅從母體血漿中檢測到了胎兒從父系繼承下來的甲基化等位基因，還檢測到從母系繼承來的胎兒非甲基化等位基因，說明胎兒與母體之間的基因位點上存在不同的甲基化形式。這一結果為無創傷性診斷胎兒非整倍體提供了依據。

Chim等[5]的研究顯示，編碼maspin基因的SERPINB5基因在胎盤細胞中處于低甲基化，而在母血細胞中處于高甲基化。因為胎盤是血漿中游離胎兒DNA的主要來源，而母血細胞是血漿中母體DNA的主要來源。推測利用胎兒和母血細胞之間存在的DNA甲基化狀態的差異，可以進行胎兒非整倍體的檢測。唐氏綜合征由于其發病率高而備受關注，為了尋找21號染色體的表觀遺傳標記，Hulten[6]采取了3種策略進行篩選，結果在21q22.3發現了3個差異甲基化序列。其中AIRE基因啟動子區域的CpG位點高度差異甲基化，可作為無創性產前診斷唐氏綜合征重要的候選表觀遺傳標記。Chim等[7]采用甲基化敏感的單核甘酸引物延伸和（或）重亞硫酸鹽測序的方法，系統性搜尋21號染色體上的甲基化位點，在114個CpG島中，有22個顯示出母體和胎兒間的表觀遺傳學差異。隨著這些表觀遺傳標記研究的不斷深入，有可能使無創傷性產前診斷胎兒染色體非整倍體成為現實。

1.3 利用孕婦血漿中細胞游離胎兒mRNA檢測胎兒非整倍體

2000年Poon等[8]在孕有男性胎兒的孕婦血漿中首次檢測到Y染色體特異性鋅脂蛋白（ZFY）mRNA。此后多項研究證實了孕婦外周血中存在著游離胎兒RNA。它們主要來自于胎盤，在孕婦血漿中含量豐富，具有極好的穩定性，并且與血漿中胎兒的DNA一樣，于產后迅速從血漿中清除。據此推斷，利用孕婦外周血中游離RNA檢測胎兒異常是可行的。選擇細胞游離胎兒RNA進行無創傷性產前診斷的主要優勢在于基因轉錄的mRNA的多拷貝性。另一個優勢是胎盤表達的特異mRNA種類是母體任何組織都無法表達的，易于檢測。與前述的利用表觀遺傳學差異選擇胎兒特異的標記物一樣，分析胎盤來源的RNA類似利用胎兒DNA檢測Y特異序列或Rh D血型，母體血漿中完全缺乏這種物質，因此檢測不受強大的母體DNA背景干擾。

2 臨床應用中的相關問題

2.1 無創性產前診斷技術是篩查還是診斷

回答這個問題牽涉到兩個方面，即向哪些人群提供這項技術以及如何使用這些技術。是否所有的孕婦都需要在早孕期進行該技術的檢查？如果在唐氏篩查高危人群中，是否需要把無創性產前診斷列同有創性介入性診斷一起作為一種選項？影響這些問題的答案受制于多種因素如技術的精確性，可擴展性，實驗室檢查持續的時間和成本-效益。顯然，成本-效益無疑是非常重要的，這也是其中的難點之一。那我們有必要對所有的孕婦提供無創技術嗎？

在歐美國家，政府制訂的政策為所有妊娠婦女均需要進行唐氏綜合征的篩查或診斷。早孕期唐氏篩查的比例在逐漸升高，和中孕期唐氏篩查相比，早孕期篩查有更低的假陽性率。在英國，如果早孕期唐氏篩查風險高于1/150，則該孕婦需要接受侵入性的產前診斷[9]。早孕期篩查同樣能夠應用于妊娠并發癥如子癇前期、胎兒宮內生長受限、胎兒心臟結構異常及其他遺傳綜合征等。在無創性產前診斷技術的應用過程中，需要超聲提供胎兒準確的胎齡及胎兒的數量來確保檢查的準確性。在一些唐氏篩查策略非常完善的國家，是否有必要用新的策略來代替現有的篩查方案也值得考慮。

我們把無創性產前診斷技術作為序貫篩查的一部分，還是作為介入性產前診斷技術的替代品？這個問題屬于各個國家自主選擇的范疇，從全球范圍經濟效費比（效用/費用的比例）考慮，完全替代現有的篩查方式顯然并不可取。從現有的早孕期唐氏篩查方案看，現有的篩查方法是能夠有效檢測出唐氏綜合征的。從篩查的角度看，目前早孕期唐氏篩查的檢出率，假陽性率和假陰性率是可以令人接受的。

2.2 經濟學因素

無創性產前診斷與侵入性產前診斷之間的關系是目前探討的熱點。無創性產前診斷花費的多少取決于整個衛生系統在唐氏篩查與診斷路徑中對于無創性產前診斷作用的認識。在不同的國家，根據不同的特點采取不同的態度。顯然，隨著技術的發展，無創性產前診斷技術的成本會不斷下降，而其檢測的精確性會不斷提高。

以英國為例，結合最新報道的文獻[10]，我們來探討無創技術在唐氏篩查策略中的作用。在這項研究中，假定的篩查策略是將所有早孕期唐氏篩查高危的婦女都進行無創性產前診斷，如果無創檢測發現陽性結果則進行介入性產前診斷。如果以唐氏綜合征目前的發病率進行預測，則每50萬名孕婦中可能有1 389例唐氏兒出生。以目前英國早孕期唐氏篩查截斷值1/150計算，大約13 646名孕婦需要進行無創性產前診斷，其中進行無創檢測陽性的1 305名孕婦需要進行絨毛活檢術，進行胎兒染色體和性別分析的檢查。13名孕婦手術出現流產（以1.0%的胎兒丟失率計算），1 169個唐氏兒能夠得到確診。如果以每個無創性檢測需要￡ 200，則全部的篩查與診斷費用需要￡ 29 700 000。

如果相同的早孕期唐氏篩查截斷值下，高危孕婦不做無創性產前診斷，則所有13 646名孕婦均需要進行絨毛活檢術，發生流產的孕婦為136名，通過侵入性診斷可以檢測出1 181個唐氏兒。全部的費用需要￡ 31 800 000。通過該研究發現，采取無創性產前技術后，能夠降低正常胎兒因接受有創檢測發生流產的風險，換言之，避免了不必要的有創穿刺和流產。

如果將早孕期篩查的截斷值提高，則顯然會有更多的孕婦需要接受無創性產前診斷，可以有更多的唐氏兒被檢測出，但總體的花費需要增加。舉例說明，如果篩查的截斷值為1/2 000，檢出率可以達到98.0%，50萬名孕婦中大約94 000名孕婦需要接受無創性產前診斷，大約1 348例唐氏兒可以被檢測出。如果每例無創檢測費用仍然為￡ 200，則總體花費達到￡ 46 200 000。如果每例無創的檢測費用降低至￡ 50，則該篩查方案的費用與目前早唐篩查1/150采取絨毛活檢方案的費用基本相似，但流產的風險更低，且有更多唐氏兒（167）能被檢測出。

假如，我們放棄目前的早孕期唐氏篩查，全部采取無創性產前診斷技術的話，假設每例檢測費用在￡ 50，總體的費用甚至比序貫篩查更低。無創技術和早唐篩查相比有更高的檢出率（99.0%），該技術有1.0%的假陽性率，約6 300名孕婦需要接受絨毛活檢術，約為目前篩查方案需要接受侵入性檢測孕婦數目的一半。

直至目前，關于無創技術在產前的適用范圍仍然在進一步的討論中。目前的文獻報道中，該技術主要應用于唐氏篩查的高危人群，其中也有假陽性的存在，這顯示了有創性產前診斷技術存在的必要性。我們把無創性產前診斷技術視為“高級篩查”，這同時也顯示，對于假陰性的存在也是需要引起重視的。目前的研究表明，無創技術的假陰性較低，但目前提供的研究存在一定的局限性，比如，研究的樣本量較小，研究對象多集中于唐氏高危孕婦而非普通人群。對于該技術精確性的評判需要進一步的研究。

從健康專業角度考慮，除非該項技術已被證明精確性非常之高，否則不宜在全球進行大范圍的推廣。但是這樣的觀點往往并不與孕婦的意見一致。顯然在對待無創技術的應用意見上，存在很多的分歧。一項來自英國的報道顯示，與專業醫生著眼于無創技術的準確性相比，孕婦更加愿意接受其顯著的安全性。與此類似的一份美國的研究顯示，孕婦對無創技術主要關注的是其安全性（75.0%），關注度遠遠高于精確性（13.0%）或更早的得知結果（7.0%）[11]。

2.3 倫理方面的討論

對于無創技術的倫理及社會學討論目前主要集中在以下方面：孕婦接受無創技術的檢測是否經過充分的知情告知，對于終止妊娠數量增加所帶來的社會壓力等。令人擔心的一個問題是，孕婦往往并不清楚這項技術的方法與用途，僅僅簡單的認為是一項血液檢測。這樣類似的問題同樣也暴露在唐氏篩查的過程中，隨著無創技術的便捷性，終止妊娠也變得更加隨意。

目前可以看到的前景是將無創性產前診斷技術引入到已成熟的唐氏篩查系統中。以往孕婦拒絕唐氏篩查和產前診斷的理由往往是擔心流產的風險。目前的序貫篩查方案由于侵入性產前診斷技術的風險使得孕婦在選擇接受唐氏篩查時，心理存在一定的阻礙。如果該方案降低了流產的風險，孕婦可能不難作出自己的決定。因此，將無創性技術引入到產前篩查中，有助于孕婦的知情決策。另一關鍵點是對醫學專業人員進行教育，以便能夠對患者進行正確的咨詢和指導。無論哪種篩查方案，無論何種技術，均存在自身的局限性。任何的篩查手段均有假陽性和假陰性的存在，如何讓孕婦在現有的條件下酌情選擇篩查的方案，在總體人群中切實降低流產的發生，提高唐氏綜合征的檢出率是我們努力的目標。

2.4 商業因素

就現在開展的這些無創性產前診斷技術，多數是通過商業行為提供的。對于這些新技術，一線臨床醫生并不十分確切的了解它們適用的最佳人群、檢驗的成本、以及如何正確的解讀實驗室報告，但他們卻需要承擔對患者的咨詢。顯而易見的是，臨床醫生可能會過度把握無創技術的適應癥。從患者需求的角度看，無創技術由于其特有的優越性，無須過多宣傳，患者的接受度會很好。因此，許多供應商把無創性產前診斷作為抓住市場的重要機會。某些公司宣傳自己擁有該技術的全部知識產權，但目前法律上的訴訟并不完全支持這樣的觀點。隨著技術的不斷發展，法律上的糾紛并不會因此而減少。作為圍產醫學專業的醫生，應盡可能避免商業因素成為篩查策略的考慮因素，應該客觀的看待不同公司所提供的技術存在的利與弊。

3 小結

無創性產前診斷技術無疑是一個充滿活力的全新的發展方向，近10年來的表現非常奪目。它的飛速發展除了實驗室技術的進步以外，臨床迫切的需求和轉化醫學研究的開展也是其發展的主要推動力。然而，該技術要在全球范圍內廣泛得到推廣仍有漫長的道路要走。這項技術取得進展的同時，如何對它的應用范圍、技術局限有清晰的認識、如何對患者進行正確的臨床指導，有賴于進一步的研究和經驗積累。正確有效的咨詢能夠使患者充分了解各項技術的利弊并選擇最有利于自身的方案，并盡力避免商業因素成為臨床醫生作出決策的干擾。對于一個產前篩查平臺所要求達到的終極目標是能夠進行高通量的篩查，達到非常高的檢出率、很低的假陽性率和假陰性率，盡可能避免對孕婦的損傷，避免正常妊娠的胎兒丟失，能夠具有一定的成本效益。在這些方面，無創性產前診斷技術顯然具有非常好的前景。

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