兒童侵襲性感染大腸埃希菌的耐藥情況

李偉，陶云珍，王運中，徐俊，魏佳，季健(通信作者)

蘇州大學附屬兒童醫院 (江蘇蘇州 215025)

大腸埃希菌是兒童感染性疾病常見的病原菌，可定植在腸道，也可引起呼吸道感染、尿道感染、血流感染等腸外感染[1]。近年來，隨著免疫抑制劑使用和侵入性治療措施的開展，兒童大腸埃希菌血流感染所致的膿毒癥發病率明顯增高，同時其可侵入腦脊液，導致腦膜炎或腦膜腦炎[2]。大腸埃希菌毒力強，所致的膿毒癥、腦膜炎或腦膜腦炎等侵襲性感染是兒童尤其是新生兒重要感染性疾病，可造成患兒各系統嚴重損害，甚至危及生命[3]。此外，隨著抗菌藥物的廣泛使用，大腸埃希菌耐藥現象日趨嚴重[4]?；诖?，本研究探討蘇州地區兒童血液和腦脊液等侵襲性感染大腸埃希菌的分布與耐藥情況，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株

以蘇州大學附屬兒童醫院2018年1月至2019年12月患兒血液、腦脊液等穿刺獲得的體液標本中檢出的大腸埃希菌作為研究對象(剔除同一患兒重復菌株)，所有菌株均采用全自動基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS，BRUKER)鑒定。

1.2 方法

1.2.1細菌基因組提取

采用煮沸-冷凍法快速提取大腸埃希菌基因組DNA[5]；采用接種環挑取一環大腸埃希菌菌落，將其置于含有1 ml無菌水的EP管中，振蕩混勻，然后將EP管置于100 ℃金屬浴中30 min，取出后放入-20 ℃冰箱冷凍30 min，之后室溫完全解凍，然后以10 000 rpm離心2 min，取上清液加入新的EP試管中，采用紫外分光光度法測定其濃度和純度后將其置于-20 ℃冰箱作為模板保存備用[6]。

1.2.2藥敏試驗

采用全自動細菌藥敏分析儀(VITEK 2 compact system，bioMérieux)和紙片擴散法對分離的大腸埃希菌進行藥敏分析，結果參照美國國家和臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)最新標準判讀[7]。

1.2.3β-內酰胺類抗生素耐藥相關基因檢測

采用文獻中報道的碳青霉烯酶基因(NDM-1、OXA-1、VIM-1、KPC-2、IMP-4、AIM-1、GIM-1、SIM-1、SPM-1、BIC-1、DIM-1)[8]、超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)基因(TEM-1、CTX-M-14、SHV-1、VEB-1、PER-1)[9]和AmpC酶基因(ACT-1、FOX-1、CIT-1、CMY-2、DHA-1、ACC-1、MOX-1、EBC-1)引物序列[10]，其均委托北京擎科生物科技有限公司上海分公司合成；采用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測大腸埃希菌中各基因攜帶情況，PCR反應總體積25 μl︰ddH2O 9.5 μl，上下游引物(10 μΜ)各1 μl，DNA模板1 μl，2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)12.5 μl，擴增條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(30個循環)，72 ℃ 10 min；采用2%瓊脂糖凝膠電泳法分析PCR擴增產物，其均委托北京擎科生物科技有限公司上海分公司測序并進行比對。

1.3 質量控制

采用大腸埃希菌標準菌株ATCC25922進行質量控制。

1.4 統計學處理

采用WHONET 5.6軟件對數據進行統計學分析。

2 結果

2.1 臨床分布

本研究涉及67例患兒，其中男44例(65.67%)，女23例(34.33%)，男女比例約為1.91∶1；年齡<1個月30例(44.78%)，1～12個月21例(31.34%)，1～18歲16例(23.88%)；共分離到67株侵襲性大腸埃希菌，其中血液標本中59株(88.06%)，腦脊液標本中8株(11.94%)，主要分布在新生兒科、血液科、重癥監護室等科室，見表1。

表1 兒童侵襲性大腸埃希菌的科室分布情況(67株)

2.2 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示，67株侵襲性大腸埃希菌對亞胺培南、美羅培南、厄他培南和丁胺卡那霉素均不耐藥，對氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、環丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、慶大霉素、妥布霉素、頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢唑肟、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率也較低，見表2；同時，產ESBLs的侵襲性大腸埃希菌有25株，產酶率為37.31%。

表2 兒童侵襲性大腸埃希菌的耐藥情況

2.3 耐藥基因攜帶情況

PCR結果顯示，67株侵襲性大腸埃希菌中檢出的碳青霉烯酶基因為NDM-1和OXA-1，ESBLs基因為TEM-1和CTX-M-14，AmpC酶基因為ACT-1、FOX-1、CIT-1、CMY-2和DHA-1，其余碳青霉烯酶基因、ESBLs基因和AmpC酶基因均未檢出，見表3。

表3 兒童侵襲性大腸埃希菌的耐藥基因分布情況(67株)

3 討論

大腸埃希菌是院內感染重要病原菌，也是兒童感染性疾病主要病原菌[11]。有資料顯示，大腸埃希菌在醫院感染標本中的分離率達50%，其中產ESBLs菌株的分離率更高，容易引起暴發流行[12]。此外，碳青霉烯酶耐藥的大腸埃希菌(carbapenem-resistant Escherichia coli，CREC)已成為全世界的公共衛生威脅，而且碳青霉烯酶、ESBLs、AmpC酶等耐藥基因極易在菌株間傳播，導致耐藥菌產生和擴散，從而影響治療效果[7-10]。本研究結果顯示，67株侵襲性大腸埃希菌整體耐藥率不高，但對氨芐西林和復方新諾明有很高的耐藥率，對頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松和左氧氟沙星有較高耐藥率，這些藥物治療效果可能不佳；另外，本研究中未檢出亞胺培南、美羅培南或厄他培南耐藥的侵襲性大腸埃希菌，說明67株侵襲性大腸埃希菌中無高耐藥的CREC，提示碳青霉烯類藥物對大腸埃希菌有較高的穩定性。

兒童用藥有其獨特性，且有很多臨床限制，根據藥敏試驗結果，可以優先選擇毒性小的藥物，合理選擇使用抗生素[13]。病原菌耐藥基因檢測也是提高用藥針對性和治療有效性的關鍵[14-15]。本研究中共檢測了11種碳青霉烯酶基因，結果只檢測到NDM-1基因2株和OXA-1基因1株，說明本研究中兒童侵襲性大腸埃希菌產耐碳青霉烯酶較少；5種ESBLs基因中，共檢出TEM-1基因42株和CTX-M-14基因23株；8種AmpC酶基因中，共檢出ACT-1基因43株、FOX-1基因30株、CIT-1基因2株、CMY-2基因2株和DHA-1基因1株。上述結果說明，本研究中兒童侵襲性感染大腸埃希菌β-內酰胺類抗生素耐藥機制主要是攜帶TEM-1、CTX-M-14、ACT-1和FOX-1等基因。

綜上所述，蘇州地區兒童侵襲性感染大腸埃希菌整體耐藥率不高，也未檢出CREC，但是攜帶了較高比例的ESBLs基因和AmpC酶基因，應引起臨床醫師重視。