HPLC法測(cè)定川滇榿木中綠原酸的含量

尹臘梅，楊曉珍，曹艷花，劉婷，肖培云

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

HPLC法測(cè)定川滇榿木中綠原酸的含量

尹臘梅，楊曉珍，曹艷花，劉婷，肖培云*

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

目的：建立HPLC法測(cè)定川滇榿木中綠原酸的含量。方法：采用高效液相色譜法，Venusil X BP-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸溶液（8∶92），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為324 nm，柱溫25℃。結(jié)果：綠原酸在0.108 8 μg~ 1.088 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 9，平均加樣回收率為98.98%，RSD=0.77%（n=6）。結(jié)論：本法操作簡便、快速、穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好，可用于川滇榿木中綠原酸含量的測(cè)定。

川滇榿木；綠原酸；高效液相色譜

川滇榿木（Alnus ferdinandi-coburgii）為樺木科榿木屬植物，為中國特有植物。分布于中國大陸的貴州、四川、云南等地，在民間被廣泛用于治療鼻衄，腸炎，痢疾等癥。有研究顯示，榿木屬植物主要含有二芳基庚烷類化合物〔1〕和齊墩果酸、喜樹堿、綠原酸〔2〕等化學(xué)成分，并具有抗氧化活性和抗腫瘤成分〔3-4〕。現(xiàn)代研究表明：綠原酸對(duì)急性咽喉炎癥和化膿性皮膚疾病療效顯著，具有抗菌、利膽、抗病毒、增加白血球、止血以及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用〔5-7〕，有著獨(dú)特的醫(yī)療、保健功能。本實(shí)驗(yàn)研究采用高效液相色譜法測(cè)定榿木各部位中綠原酸的含量，為榿木資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，包括G1315A/BDAD檢測(cè)器，G1313A ALS自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent 1100色譜工作站）；SB2200超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AE240電子天平（瑞士梅特勒）；KL-UPUV-20超純水儀（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥榿木（采自大理蒼山，由大理學(xué)院生藥學(xué)教研室楊月娥老師鑒定）；綠原酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110753-200413）；高效液相用甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Venusil XBP-C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（8∶92）；檢測(cè)波長：324 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。對(duì)照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品（A）及樣品（B）HPLC色譜圖（1-為綠原酸）

2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取綠原酸對(duì)照品5.44 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.544 0 mg/mL的儲(chǔ)備液。精密移取儲(chǔ)備液1 mL于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得濃度為0.108 8 mg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備精密稱取榿木藥材粉末1 g，置100 mL具塞圓底燒瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，密塞，稱重，超聲處理30 min，用60%甲醇補(bǔ)足減失重量，用0.45 μm過濾器濾過，即得。

2.4 線性關(guān)系考察精密吸取濃度為0.108 8 mg/mL的綠原酸對(duì)照品溶1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、10.0 μL依次進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=1 186.6X+ 87.123（r=0.999 9），結(jié)果表明綠原酸在0.108 8~ 1.088 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)取濃度為0.108 8 mg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定綠原酸的峰面積，RSD為0.35%（n=6）。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)稱取同一批次榿木花樣品1份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，按“2.1”項(xiàng)色譜條件在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，得綠原酸峰面積的RSD為 0.68%，結(jié)果表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)稱取同一批次榿木花樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果綠原酸含量的平均值為1.045 mg/g，RSD為1.36%（n=6）。

2.8 回收率試驗(yàn)精密稱取已知綠原酸含量（1.045 mg/g）的榿木花樣品6份，每份約0.5 g，分別精密加入0.544 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，加60%甲醇24 mL，密塞，稱重，超聲提取30 min，用60%甲醇補(bǔ)足減失重量，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測(cè)定分別稱取采自大理蒼山三個(gè)不同地點(diǎn)的榿木皮、葉、木質(zhì)、花、果實(shí)樣品粉末各1g，采用“2.3”項(xiàng)制備樣品液，并在“2.1”項(xiàng)色譜條件下對(duì)其綠原酸的含量進(jìn)行測(cè)定，見表2。

表2 榿木各部位中綠原酸的含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

實(shí)驗(yàn)分別以不同提取時(shí)間，不同甲醇濃度考察川滇榿木各部位中綠原酸的提取工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用60%甲醇超聲提取30 min可將各部位中綠原酸提取完全。

實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了川滇榿木皮、葉、木質(zhì)、花、果實(shí)中綠原酸的含量，結(jié)果表明花中綠原酸的含量最高，達(dá)1.2 mg/g（0.12%），與《中國藥典》2010年版一部收載的杜仲葉（≥0.080%）、忍冬藤（≥0.10%）、菊花（≥0.20%）藥材中綠原酸的含量相當(dāng)，低于藥典中綠原酸含量較高的金銀花（≥1.50%）〔8〕，但仍具有一定的開發(fā)利用價(jià)值。

在進(jìn)行流動(dòng)相的選擇時(shí)，實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液等多種不同配比，結(jié)果流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸（8∶92）時(shí)出峰時(shí)間適當(dāng)，綠原酸與鄰峰能達(dá)到較好基線分離，峰的對(duì)稱性好，故選擇乙腈-0.4%磷酸（8∶92）為該實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)建立的高效色譜法測(cè)定榿木中綠原酸的含量，方法簡便、快捷，靈敏度高，穩(wěn)定性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于川滇榿木各部位中綠原酸的含量測(cè)定。

〔1〕怡悅.從日本榿木提取物分離的抗氧化物質(zhì)及其構(gòu)效相關(guān)性〔J〕.國外醫(yī)學(xué)：中醫(yī)中藥分冊(cè)，2002，24（4）：249.

〔2〕陳睿，張國林.尼泊爾榿木和崖角藤的化學(xué)成分研究〔D〕.北京：中國科學(xué)院研究生院，2007.

〔3〕田珍.俄雷岡榿木中的抗腫瘤成分〔J〕.國外醫(yī)學(xué)：藥學(xué)分冊(cè)，1974，4.

〔4〕郗硯彬，王金.日本榿木中新的二芳基庚烷類化合物及其抗氧化活性〔J〕.國際中醫(yī)中藥雜志，2006，28（2）：103.

〔5〕劉軍海，裘愛泳.綠原酸及其提取純化和應(yīng)用前景〔J〕.糧食與油脂，2003（9）：44.

〔6〕吳衛(wèi)華，康楨，歐陽冬生，等.綠原酸的藥理學(xué)研究進(jìn)展〔J〕.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18（4）：691.

〔7〕林宏.金銀花藥理研究進(jìn)展〔J〕.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，21（6）：82.

〔8〕國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部〔S〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010，154-206.

（責(zé)任編輯 李楊）

Determination of Chlorogenic Acid in Alnus ferdinandi-coburgii by HPLC

YIN Lamei,YANG Xiaozhen,CAO Yanhua,LIU Ting,XIAO Peiyun*
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To establish an HPLC method for the determination of chlorogenic acid in Alnus ferdinandi-coburgii. Methods:We applied highly effective liquid phase chromatography,with Venusil X BP-C18column（150 mm×4.6 mm,5 μm）and mobile phase consisted of acetonitrile-0.4%phosphoric acid solution（8∶92）at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 324 nm,and column temperature was 25℃.Results:There was good linearity in the range of 0.108 8-1.088 μg（r=0.999 9）of chlorogenic acid.The average recovery was 98.98%,RSD was 0.77%（n=6）.Conclusion:The method above was simple,sensitive, accurate,reproducible,and could be applied in the measurement of chlorogenic acid in Alnus ferdinandi-coburgii.

Alnus ferdinandi-coburgii;chlorogenic acid;HPLC

R284

A

1672-2345（2013）06-0020-03

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.06.006

大理學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（DXSKYYX201318）

2013-03-28

2013-04-19

尹臘梅，藥學(xué)專業(yè)2010級(jí)本科生. *通信作者：肖培云，教授.