鈣網蛋白免疫調節的分子機制研究

吳薇 劉朝奇

（三峽大學分子研究所，宜昌 443002）

鈣網蛋白（Calreticulin，CRT）是一種在結構和功能上高度保守的鈣結合蛋白，主要存在于內質網（endoplasmic reticulum，ER）［1]。大量研究發現，鈣網蛋白具有多種功能，參與抗原提呈、分子伴侶、抑制血管生成及細胞黏附等生物學作用。因此，與多種疾病的發生發展有一定的相關性。但鈣網蛋白免疫調節作用分子機制的研究甚少，因此本研究從鈣網蛋白在免疫調節增強及免疫逃避方面對其分子機制進行綜述，并期望能為這一領域的科研工作者提供一些參考。

1 CRT的免疫增強活性

1.1 CRT與吞噬作用

機體對凋亡細胞的清除是正常的基本的生理功能，這個過程對于維持機體的內環境穩定具有重要意義。目前，比較明確的凋亡細胞膜上的受體識別配體是磷脂酰絲氨酸（phosPhatidylserine，PS），PS的外翻表明細胞凋亡的發生。

近幾年的研究發現，CRT也參與巨噬細胞對凋亡細胞的清除過程［2]，CRT與人精子蛋白（ERP57）共轉位至膜表面會引起免疫原性的細胞死亡［3]，主要是通過囊泡相關膜蛋白（SNARE）依賴的胞吐作用轉位至膜表面，這個過程可能與囊泡相關的SNARE蛋白（如囊泡相關膜蛋白1）和膜相關SNARE蛋白（如突觸小體相關蛋白23/25）的相關［4]。

凋亡細胞表面CRT將會促進吞噬細胞的識別及吞噬作用，用siRNA技術將CRT基因沉默后會抑制吞噬細胞對凋亡細胞的吞噬作用［5]。誘導內質網應激反應的發生將會活化絲氨酸-蘇氨酸激酶蛋白激酶樣內質網激酶（protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）信號路線，主要表現為Ca2+離子的外流伴隨著PERK980位蘇氨酸的磷酸化，后者會導致真核起始轉錄相關因子2a（eIF2α）的磷酸化（51位蘇氨酸），接著進入凋亡前期并伴一些凋亡相關因子活化，如半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-8（caspase 8），bcl-2相關蛋白X（bcl-2-associated protein X，Bax）［6，7]。以上研究均突出了CRT在吞噬作用中的重要性。

在用藥物誘導CRT的膜轉位時，蒽環類相比較其他細胞毒性制劑如奧沙利鉑、順鉑，可以誘導免疫原性的腫瘤細胞死亡，即蒽環類藥物可以引起細胞死亡并刺激機體產生抗腫瘤免疫反應而增強治療效果，主要機制是活化PERK依賴的eIF2α磷酸化信號途徑引發內質網腔的鈣網蛋白膜轉位至細胞表面［8]。PERK，caspase-8或者SNAREs的基因敲除對蒽環類誘導的細胞凋亡沒有影響，但破壞了凋亡細胞的免疫原性，加入外源性的鈣網蛋白可恢復其免疫原性［6]。

1.2 抗原提呈

主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）在抗原提呈過程中發揮主要作用。一些研究發現［9]，CRT 具有廣泛的連接蛋白質以及內質網腔內特定序列糖基化多肽的能力，抗原多肽會被TAP聯合gp96、CRT或PDI 轉運至內質網腔，而CRT 能與 MHC-I類分子A1區天冬酰胺連接的多聚糖結合，在 MHC-I 分子的折疊和組裝過程中起作用［10]。MHC-I 類分子/抗原復合物由 CRT、TAP、tapasin，以及 MHC-I 類分子重鏈 β-2 微球蛋白（β-2m）共同組成，其中，CRT 發揮相關運載體功能，它利用抗原加工相關轉運子（TAP-1，TAP-2）將多肽轉運到內質網并組裝到新生 MHC-I 類分子上，進而實現抗原提呈功能［11]。

應用基因敲除 CRT的K42 細胞的研究發現，CRTP區能抑制MHC-I類分子的表達，還能正常結合β2微球蛋白，但運載抗原肽的能力下降，外源性表達CRT 恢復該細胞抗原肽運載能力［12]。用從小鼠腫瘤細胞中分離的抗原肽/CRT 復合物免疫小鼠，觀察到小鼠脾細胞活化，產生了特異性CD8 T細胞及有效的抗同種腫瘤免疫應答，單獨使用CRT或抗原肽免疫小鼠未能誘導特異性免疫反應［13]。抗原肽正確的組裝到MHC-I 類分子重鏈 β2微球蛋白（β2m）對于MHC-I類分子的功能和結構的穩定性很重要。

1.3 CRT在細胞表面的結合配體及其信號轉導

蒽環類藥物誘導鈣網蛋白、熱休克蛋白70和90快速膜轉位至細胞表面，在處理12 h后高遷移率族蛋白B1（HMGB1）釋放，使未成熟樹突狀細胞與免疫原性腫瘤細胞的相互作用，在對腫瘤細胞的攝取增多的同時也促進樹突狀細胞的成熟。被殺傷的腫瘤細胞負載到樹突狀細胞上能有效地刺激產生腫瘤特異性的γ干擾素，從而刺激T細胞的增值，減少調節性T細胞的產生［14]。

細胞表面相關CRT蛋白在缺少跨膜區時并沒有一個明顯的信號調節機制，或者細胞表面的CRT是以糖基化和GPI結合形式存在的［15]。迄今為止，除了LRP1/CD91，并沒有其他的信號受體被證明能通過從外源性增加細胞表面CRT來介導細胞外信號。在測定不同的CRT功能時（如在體內傷口愈合試驗中通過外源性的增加CRT蛋白可以明顯的誘導細胞的遷移和增殖）是否依賴LRP1信號通路或者發現其他穿膜細胞表面結合配體。有研究發現，在沒有LRP1的情況下CRT參與細胞表面的信號轉導，可能是CRT可以通過細胞表面的碳水化合物類分子的募集來發出信號，包括蛋白聚糖類的糖苷鍵通過它的凝集素樣結合而活化［16]。

與TSP1相似，在人外周血單核細胞的表面的多功能信號免疫調節細胞表面蛋白CD69分子與CRT的N端片段可能調節包括黏附在內的一些功能［17]。細胞表面的CRT通過自身發出信號的可能性不太大，但也并不能排除這種可能性［18]。然而，鑒于CRT具有多功能活性，很有可能是非信號蛋白的結合或者聚集，這種結合和聚集的機制是通過結合或者修飾其他細胞表面的跨膜分子來調節信號。

Holoshitz［19]研究也指出細胞表面鈣網蛋白可以作為風濕性關節炎共享表位的信號轉導受體。鈣網蛋白上的共享表位結合位點位于其P區第217-223氨基酸殘基，在和樹突狀細胞相互作用后，共同表位活化有效免疫調節系統。在能高表達細胞表面鈣網蛋白的CD8陽性樹突狀細胞中，共同表位能抑制耐受性酶吲哚胺2，3二氧化酶并伴隨著調節性T細胞分化的合成抑制；在CD8陰性的樹突狀細胞中，共享表位配體會增加IL-6和IL-23的分泌，并且能刺激Th17的產生，Th17細胞是與自身免疫相關的T細胞亞型。鈣網蛋白是通過與共享表位結合來活化Th17細胞分化信號，所以在風濕性關節炎中細胞表面鈣網蛋白可能是一種致病原。

2 CRT與免疫逃避

寄生蟲在感染宿主其分泌物扮演著各種角色，包括感染的建立、結合免疫相關因子保護寄生蟲避免宿主免疫系統攻擊及組織滲透等，其中之一便是CRT。在多種寄生蟲感染，如捻轉胃蟲、克魯斯錐蟲中都發現有CRT的身影。隨著研究的進一步深入，其作用也慢慢為眾多的研究者所知。

寄生蟲感染宿主主要有兩大策略，一是抗凝血作用；二是結合某些免疫相關因子來起到保護并且避免宿主免疫系統攻擊的作用。在寄生蟲感染時，作為一種抗感染免疫機制，宿主的紅細胞會向寄生蟲及其分泌物存在的部位聚集而發揮包裹作用。然而細胞的移動及黏附是鈣依賴的，所以寄生蟲會通過分泌CRT來擾亂血細胞對自身的包裹作用［20]。研究顯示，寄生蟲在分泌的CRT同時還會與宿主體內的補體結合蛋白C1q和C反應蛋白（CRP）結合抑制經典補體活化途徑，因為CRP和C1q的結合將會活化經典途徑，CRT不僅和C1q結合，同時還結合CRP起到了雙重抑制作用［21]。在人源鈣網蛋白研究中，除了已鑒定的補體蛋白C1q結合位點，在H的N區還存在著兩個結合位點，雖然具體的機制還不是很清楚，但這種具有多個補體蛋白C1q結合位點與宿主寄生蟲相互作用是有密切聯系的［22]。

3 結語

近年來，隨著鈣網蛋白免疫調節研究的深入，對于闡明多種疾病的發生發展及相關治療措施將會有巨大的推進作用。我們及其他研究團隊都發現細胞膜上的CRT具有促進巨噬細胞吞噬活性，因此期望通過CRT基因與其他腫瘤靶向基因，如與腫瘤細胞膜上PD-L1結合的PD-1嵌合，構建獲得融合蛋白達到靶向免疫治療的目的。這種方式是借助機體自身的免疫力而非傳統藥物治療，尤其是可以避免腫瘤治療中放化療所帶來的各種副作用。但是目前大部分關于CRT免疫治療的研究都停留在細胞、動物水平上，離臨床治療應用還有一段距離。如在人體運用的安全性問題；獲得的融合蛋白純度；以及大規模生產的運輸和保存等問題。

目前，應在保證這種基因治療臨床運用的安全性的大前提下，盡可能更多地了解CRT免疫調節的機制，以及和其他基因構建獲得的融合蛋白與機體相互作用的方式。隨著研究的深入，CRT作為一種免疫治療方式的前景將會更加廣闊。

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