7個(gè)大穗型小麥-黑麥代換系間雜交后代的形態(tài)學(xué)與SSR分析

姜鹿鳴 田超 李集臨 張延明

小麥異代換系是染色體工程常用的基礎(chǔ)材料之一，是指通過染色體工程技術(shù)把攜帶外源優(yōu)良基因的染色體轉(zhuǎn)入小麥遺傳背景，替換小麥中的1條、1對(duì)或多條染色體所形成的品系或中間種質(zhì)材料［1，2］。黑麥種質(zhì)資源中有很多有利于小麥改良的優(yōu)良基因，如抗白粉病、抗旱、耐貧瘠、抗銹病等基因，對(duì)于小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)都有顯著提高，目前很多研究已將這些黑麥基因成功的應(yīng)用于小麥遺傳改良上。小麥-黑麥代換系遺傳性穩(wěn)定，育性正常，在生產(chǎn)上可以直接利用［3］。1998年，Robinovich等調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全世界大約有330多個(gè)小麥推廣品種是小麥－黑麥易位系或代換系［4］，如著名的小黑麥Armadillo是2D/2R 代換系［5］。

簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）又稱微衛(wèi)星（Microsatellite）DNA，是近年來發(fā)展起來的建立在PCR基礎(chǔ)上的第二代分子標(biāo)記，它是由一類短的串聯(lián)重復(fù)序列基序（1-6個(gè)核苷酸）組成的簡單重復(fù)序列［6］。由于SSR具有高水平的多態(tài)性、易于檢測和共顯性等特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用在小麥研究中。崔會(huì)肖等［7］用20對(duì)小麥SSR特異引物，對(duì)小麥近緣種和小麥—簇毛麥染色體代換系、易位系的基因組DNA進(jìn)行了鑒定。

為了加強(qiáng)對(duì)黑麥的遺傳及其應(yīng)用研究，進(jìn)一步發(fā)掘黑麥優(yōu)良基因資源，本研究對(duì)從小麥-黑麥代換系5R/5A與1R/1D雜交后代中選育的7個(gè)大穗型品系進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析與SSR鑒定，以了解這些品系的遺傳基礎(chǔ)及更好地利用其對(duì)小麥進(jìn)行遺傳改良。

1 材料與方法

1.1 材料

母本為小麥-黑麥代換系5R/5A，表現(xiàn)大穗、多小穗、抗病、有頸毛；父本為小麥-黑麥代換系1R/1D，表現(xiàn)大穗、大粒、小穗排列較密、抗旱，由哈爾濱師范大學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)室培育并鑒定［5］。小麥-黑麥代換系5R/5A與1R/1D（2n=42）雜交后代材料：1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11共 7個(gè)品系，由哈爾濱師范大學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制和提供。中國春（Triticum aestivum cv. Chinese Spring）、黑麥（勝利黑麥）（Secale cereale L.），由哈爾濱師范大學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室從黑龍江省農(nóng)科院引進(jìn)并保存。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 2012年7-8月于哈爾濱師范大學(xué)試驗(yàn)田對(duì)7個(gè)品系及親本進(jìn)行田間統(tǒng)計(jì)與觀察，隨機(jī)抽取20株。依據(jù)《小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》［8］對(duì)植株性狀進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察與分析，如株高、穗長、分蘗數(shù)、小穗數(shù)、百粒重、抗病性、抗旱性、頸毛和紫莖等。

1.2.2 DNA提取 取葉片放入液氮冷凍并研磨成粉末，采用CTAB法［9］提取小麥總DNA，用純水溶解備用。

1.2.3 SSR 分析 根據(jù)任如意等［10］、Robert 等［11］、Saal等［12］方法合成特異性PCR引物，引物的堿基序列、染色體位置、退火溫度等信息參見文獻(xiàn)［10-12］，合成由大連寶生物公司完成，本試驗(yàn)使用的引物序列，見表1。

反應(yīng)體系：5μL，1×PCR buffer，1.5mmol Mg-Cl2，200μmol/L dNTP，0.5U Taq 酶，40 ng 引物，40-60 ng 模板DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法染色并照相。

PCR程序：95℃ 3min 預(yù)變性；95℃變性30s，55℃或57℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；72℃延伸10min。

表1 PCR特異擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

7個(gè)品系的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，植株遺傳性穩(wěn)定，具有1R/1D的小穗排列整齊、抗條銹病、葉銹病、桿銹病；5R/5A的長穗、多小穗、有頸毛等形態(tài)特點(diǎn)。7個(gè)品系均屬于大穗型材料，穗長超過14cm，其中1-8品系可達(dá)17.0cm，1-11品系穗長達(dá)到17.5cm，7個(gè)品系的小穗數(shù)均超過20個(gè)，1-8達(dá)到24個(gè)，主要性狀及穗型，如表2和圖1所示。

表2 7個(gè)品系及親本的田間性狀

圖1 7個(gè)品系及其親本的穗形圖

2.2 DNA檢測

經(jīng)電泳和紫外分光光度計(jì)檢測試驗(yàn)材料DNA，電泳條帶都較明顯清晰，DNA質(zhì)量較好。測量OD260/ OD280的比值均接近1.8，提取的DNA能應(yīng)用SSR-PCR分析（圖2）。

圖2 DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 分子標(biāo)記分析

用篩選出的引物分析7個(gè)品系，結(jié)果（圖3）表明，有1對(duì)引物PSC119.1可以在黑麥和7個(gè)品系中擴(kuò)增出一條長約750bp的特異帶，而在中國春中沒有結(jié)合位點(diǎn)，不能擴(kuò)增出特征帶。說明檢測的植株中具有黑麥R染色體組成分。

圖3 引物PSC119.1擴(kuò)增結(jié)果

引物 SCM138-5RS，在 1-6、1-7、1-8、1-9、1-10和黑麥中擴(kuò)增出約188bp黑麥特異片段（圖4中箭頭所示），該片段在中國春、1-5與1-11中未出現(xiàn)，表明1-6、1-7、1-8、1-9、1-10中導(dǎo)入了黑麥5R染色體短臂遺傳物質(zhì)。引物SCM120-5RL在黑麥中擴(kuò)增出100-150bp4條清晰條帶（圖5）。但考慮到marker分布不均等情況，圖4中箭頭所示位置約為127bp，在此位置7個(gè)品系均擴(kuò)增出特異條帶，而中國春未出現(xiàn)條帶，從而表明7個(gè)品系中導(dǎo)入了黑麥5R染色體長臂遺傳物質(zhì)。引物TSM604-1RS可以在黑麥和7個(gè)品系中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出一條長約115bp的特異帶（圖6），而在中國春中無擴(kuò)增帶紋，表明7個(gè)品系中有來自黑麥1R染色體短臂的遺傳物質(zhì)，該引物TSM604-1RS（115bp）可作為識(shí)別7個(gè)品系的特異標(biāo)記。

圖4 引物SCM138-5RS擴(kuò)增結(jié)果

圖5 引物SCM120-5RL擴(kuò)增結(jié)果

圖6 引物TSM604-1RS擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

通過代換系間雜交將近緣種屬的有益基因?qū)胄←湥切←湼牧嫉挠行緩街弧Ｔ诠┰嚥牧掀废敌←?黑麥代換系5R/5A與1R/1D雜交的高代品系中，有的可以直接被觀察到兼具雙親性狀，例如，1R/1D的小穗排列整齊、抗條銹病、葉銹病、桿銹病；5R/5A的穗長、有莖毛、穗疏等。但是，一些性狀是由多個(gè)基因共同控制，容易受外界環(huán)境的干擾，同時(shí)由于基因的表達(dá)會(huì)有一定差異，所以依靠表型所做的標(biāo)記只能初步鑒定導(dǎo)入了外源遺傳物質(zhì)。

目前，SSR技術(shù)已經(jīng)成為小麥最為常用和高效的分子標(biāo)記系統(tǒng)。Iqbal等［13］利用SSR 標(biāo)記成功鑒定了小麥－單芒山羊草（Aegilops uniarista Vis.）7N染色體異附加系。武軍等［14］利用SSR技術(shù)對(duì)普通小麥與冰草雜交產(chǎn)生的大穗花材料4844的后代株系進(jìn)行分析，并對(duì)大穗多花材料中的冰草P染色體進(jìn)行了遺傳鑒定。Korzun等［15］以34個(gè)小麥品種間染色體代換系為材料，利用45個(gè)小麥SSR 標(biāo)記鑒定大部分代換系是正確的。

小麥-黑麥代換系5R/5A與1R/1D雜交，由于5R、5A、1R和1D有部分同源關(guān)系，小麥ph基因受R組染色體抑制，有可能產(chǎn)生部分同源聯(lián)會(huì)，從而發(fā)生染色體易位；5R/5A與1R/1D雜交，F(xiàn)1會(huì)產(chǎn)生4個(gè)單價(jià)體，單價(jià)體容易斷裂，斷裂重建，也可以產(chǎn)生易位，因此代換系5R/5A與1R/1D間雜交，可以有計(jì)劃的將1R和5R染色體片段導(dǎo)入普通小麥，創(chuàng)制易位系。

本研究選取黑麥5R、1R染色體的特異SSR引物，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，分析小麥-黑麥代換系5R/5A與1R/1D雜交后代中黑麥的遺傳成分，可降低SSR鑒定小麥背景中的外源遺傳物質(zhì)的局限性，今后研究可進(jìn)一步結(jié)合細(xì)胞學(xué)、GISH等多種方法分析鑒定小麥-黑麥代換系間雜交后代材料，為小麥遺傳改良和育種篩選良好的基礎(chǔ)材料。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用引物 SCM138-5RS，在 1-6、1-7、1-8、1-9、1-10和黑麥中擴(kuò)增出約188bp黑麥5RS特異片段；引物SCM120-5RL在7個(gè)品系和黑麥中均擴(kuò)增出127bp的5RL特異片段；引物TSM604-1RS在黑麥和7個(gè)品系中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出一條長約115bp的1RS特異帶，確定7個(gè)品系為黑麥的易位系，7個(gè)品系均表現(xiàn)大穗、多小穗、抗病、抗旱等優(yōu)點(diǎn)，有利用價(jià)值，可作為小麥品種改良的基礎(chǔ)材料。

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