美洲大蠊抗肝纖維化活性提取物中粘多糖的含量測(cè)定

李夸巧，李春艷，楊永壽，陳麗娜，肖培云

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

李夸巧，李春艷，楊永壽，陳麗娜，肖培云*

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

目的：建立美洲大蠊抗肝纖維化活性提取物ML-D中粘多糖的含量測(cè)定方法。方法：采用苯酚-硫酸法測(cè)定粘多糖的含量，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察ML-D中粘多糖的水解工藝和顯色條件，采用單因素試驗(yàn)考察加熱顯色時(shí)間、苯酚和硫酸的用量。結(jié)果：ML-D中粘多糖的最佳水解工藝為：鹽酸濃度6 mol/L，固液比為1∶1，水解時(shí)間1 h；最佳顯色條件：苯酚2 mL，硫酸20 mL，加熱顯色時(shí)間10 min。結(jié)論：該法操作簡便，精密度高，重復(fù)性好，可作為美洲大蠊抗肝纖維化活性提取物ML-D中粘多糖含量的測(cè)定方法。

美洲大蠊；抗肝纖維化；粘多糖；硫酸-苯酚法；含量測(cè)定

美洲大蠊（Periplaneta americana）為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱蟑螂，首見于《本草綱目拾遺》，又稱蜚蠊，別名滑蟲、茶油蟲、茶婆子、灶螞子、石姜、偷油郎等。入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，謂“味咸、寒；治血瘀癥堅(jiān)寒熱、破積聚、喉咽閉、內(nèi)寒無子”〔1〕。

近年來的研究表明，美洲大蠊具有保肝、抗腫瘤、抗菌、抗病毒及促進(jìn)血管增生、組織修復(fù)等作用〔2〕，文獻(xiàn)報(bào)道〔3-5〕美洲大蠊提取物還具有抗實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的作用，但作用機(jī)制尚不明確。肝纖維化是慢性肝病發(fā)展至肝硬化甚至原發(fā)性肝細(xì)胞癌的必經(jīng)階段，是各種慢性肝病的病理性基礎(chǔ)〔6-7〕，迄今，臨床尚缺乏高效、低毒的藥物來治療肝纖維化。ML-D是利用現(xiàn)代生物分離提取技術(shù)，從藥用昆蟲美洲大蠊中分離、精制得到的活性提取物，具有抑制體外肝星狀細(xì)胞增殖，抗肝纖維化的作用〔8〕，對(duì)其深入研究，有望研發(fā)出一種資源豐富、高效、低毒的抗肝纖維化的天然藥物。實(shí)驗(yàn)表明，該活性提取物含有一定量的粘糖氨酸，粘糖氨酸為粘多糖氨基酸類化合物的混合物，具有抗凝血、降血脂、抗病毒等藥理活性作用〔9-11〕，為有效控制ML-D的質(zhì)量和活性，必須建立該提取物中粘多糖的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器紫外-可見分光光度計(jì)（UV2500型，日本島津公司）；冷凍干燥機(jī)（FDU-2100型，倍捷科技）；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（101A-2B，上海崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠）；電子天平（AL204-IC，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；超聲波清洗器（SK5200H，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 材料美洲大蠊藥材由云南省大理州彌渡縣美洲大蠊養(yǎng)殖基地提供，ML-D活性提取物由云南省高校昆蟲藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，樣品批號(hào)：20120301、20120515、20120727，樣品性狀：凍干粉。

1.3 試劑葡萄糖對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：2011408），水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.15 %苯酚溶液的配制取苯酚100 g，加鋁片1 g和碳酸氫鈉0.1 g，用電熱套加熱蒸餾，收集182℃餾分，即得精制苯酚。稱取精制苯酚適量，加水溶解，配制成含5%的苯酚溶液，置棕色瓶中存放，備用，臨用前新配〔12〕。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品100 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解，定容、搖勻，即得1.0 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取儲(chǔ)備液適量，用蒸餾水稀釋成0.1 mg/mL的對(duì)照品測(cè)試液。

2.1.3 供試品溶液的制備精密稱取批號(hào)為20120301的ML-D凍干粉約50 mg于100 mL圓底燒瓶中，加6 mol/L鹽酸50 mL，密封，置90℃恒溫干燥箱中水解1 h，冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2 顯色條件的考察

2.2.1 苯酚用量考察精密移取“2.1.3”項(xiàng)下的供試品液10 mL于50 mL量瓶中，共6份，分別加5%苯酚0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，再各加20 mL濃硫酸，置沸水浴中加熱顯色10 min，冷卻，用10 mol/L的硫酸定容至刻度，于490 nm〔12〕處測(cè)定吸光度，結(jié)果表明苯酚的用量為2 mL時(shí)吸光度值最大。

2.2.2 濃硫酸用量考察精密移取“2.1.3”項(xiàng)下的供試品溶液10 mL，共6份，各加2 mL 5%的苯酚溶液，分別加入5、10、15、20、25、30 mL的濃硫酸，按“2.2.1”項(xiàng)下顯色測(cè)定，結(jié)果表明濃硫酸用量為20 mL時(shí)吸光度值最大。

2.2.3 加熱顯色時(shí)間考察精密移取“2.1.3”項(xiàng)下的供試品溶液10 mL于50 mL量瓶中，共7份，各加2 mL 5%的苯酚溶液、20 mL濃硫酸，置沸水浴中分別加熱顯色0、5、10、15、20、25、30 min，冷卻，用10 mol/L硫酸定容至刻度，于490 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果表明加熱顯色10 min時(shí)吸光度值最大。

2.3 水解條件考察

2.3.1 鹽酸濃度考察精密稱取ML-D凍干粉12份，每份約50 mg于100 mL圓底燒瓶中，分別加濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 mol/L的鹽酸50 mL，密封，置90℃恒溫干燥箱中水解1 h，冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，用蒸餾水定容至刻度搖勻。取水解后的供試品溶液10 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下顯色測(cè)定，結(jié)果表明鹽酸的濃度為6 mol/L時(shí)吸光度值最大。

2.3.2 鹽酸用量考察精密稱取ML-D凍干粉10份每份約50 mg，于100 mL圓底燒瓶中，分別加6 mol/ L的鹽酸10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mL置90℃恒溫干燥箱中加熱水解1 h，按“2.2.1”項(xiàng)下顯色測(cè)定，結(jié)果表明鹽酸的用量為50 mL時(shí)吸光度值最大。

2.3.3 水解時(shí)間的考察精密稱取ML-D凍干粉8份，每份約50 mg于100 mL圓底燒瓶中，各加6 mol/L的鹽酸50 mL，置90℃恒溫干燥箱中加熱水解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，按照“2.2.1”項(xiàng)下顯色測(cè)定，結(jié)果表明加熱水解1.0 h時(shí)吸光度值最大。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素考察的結(jié)果，進(jìn)一步用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察ML-D凍干粉中粘多糖的含量測(cè)定條件。

2.4.1 水解工藝的正交試驗(yàn)以水解時(shí)間（A）、固液比（B）、鹽酸濃度（C）為因素，以樣品中粘多糖的含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用L9（34）表安排試驗(yàn)，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 水解工藝的因素水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，因素B（固液比）對(duì)實(shí)驗(yàn)有顯著影響，因素A（水解時(shí)間）和因素C（鹽酸濃度）對(duì)實(shí)驗(yàn)影響較小。因此美洲大蠊提取物中粘多糖的最佳水解工藝為A2B2C2，即鹽酸的濃度為6 mol/L，固液比為1∶1，加熱水解1.0 h。

2.4.2 水解條件的驗(yàn)證試驗(yàn)精密稱取ML-D凍干粉5份，每份約50 mg，按最佳水解工藝操作，以驗(yàn)證該工藝的合理性和穩(wěn)定性，按“2.2.1”項(xiàng)下顯色測(cè)定，得粘多糖含量的平均值為120.81 mg/g，RSD值為2.1%，表明該水解工藝可行、穩(wěn)定、可靠。

2.4.3 顯色條件的正交實(shí)驗(yàn)以顯色時(shí)濃硫酸的用量（A）、苯酚的用量（B）、顯色時(shí)加熱時(shí)間（C）為因素，以樣品中粘多糖的含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用L9（34）表安排試驗(yàn)，因素水平見表3，結(jié)果見表4。

表3 顯色條件的因素水平

表4 顯色條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，美洲大蠊提取物中粘多糖的最佳顯色條件為A3B2C1，即濃硫酸最佳用量為20 mL，5%苯酚用量為2 mL，在沸水浴中加熱顯色10 min。

2.4.4 顯色條件的驗(yàn)證性試驗(yàn)精密稱取ML-D凍干粉5份，每份約50 mg，按最佳水解工藝和最佳顯色條件操作，以驗(yàn)證該工藝的合理性和穩(wěn)定性得粘多糖含量的平均值為133.05 mg/g，RSD值為1.7%，表明該水解工藝穩(wěn)定、可靠。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密移取“2.1.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、11.0 mL置50 mL量瓶中，按最佳顯色條件顯測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 26.69X+0.1224，r=0.9994，結(jié)果表明葡萄糖對(duì)照品溶液在2.0~22.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 精密度試驗(yàn)精密移取同一對(duì)照品溶液10 mL置50 mL量瓶中，按最佳顯色條件顯色，連續(xù)測(cè)定6次，吸光度的RSD為0.71%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取批號(hào)為20120301的ML-D凍干粉5份，每份約50 mg，按最佳水解工藝和最佳顯色條件操作，得粘多糖含量平均值為135.96 mg/g，RSD為1.25%表明該方法的重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取批號(hào)為20120301的ML-D凍干粉1份，約50 mg，按最佳水解工藝和最佳顯色條件測(cè)定，每間隔30 min測(cè)量一次吸光度，連續(xù)考察2 h，RSD為2.41%，表明樣品在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn)精密稱取批號(hào)為20120301的ML-D凍干粉6份，每份約25 mg，分別加入3.4 mg的葡萄糖對(duì)照品，按最佳水解工藝和最佳顯色條件測(cè)定，結(jié)果葡萄糖的平均回收率為99.83%，RSD為1.31%。

2.9 樣品的測(cè)定精密稱取批號(hào)為20120301、20120515、20120727的ML-D凍干粉，每個(gè)批號(hào)3份，每份約50 mg，按最佳水解工藝和最佳顯色條件測(cè)定，結(jié)果見表5。

表5 供試品測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

苯酚硫酸法是測(cè)定多糖含量的常用方法之一，其原理是多糖或寡糖在一定溫度下被濃硫酸水解為糠醛衍生物，其衍生物與苯酚反應(yīng)生成橙黃色物質(zhì)，在一定濃度范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比。

由于美洲大蠊提取物ML-D中的多糖與蛋白質(zhì)、氨基酸結(jié)合形成結(jié)構(gòu)牢固的糖蛋白和黏糖氨酸類化合物，試驗(yàn)過程中曾試驗(yàn)直接用苯酚-硫酸進(jìn)行顯色測(cè)定，由于其中的糖不能完全被硫酸水解，吸光度值非常小，因此先用鹽酸進(jìn)行水解，然后再進(jìn)行顯色測(cè)定。

本試驗(yàn)還考察了濃硫酸用量和取樣量的關(guān)系當(dāng)供試品的用量小于5 mg，濃硫酸的用量為20 mL時(shí)，取樣量與吸光度值呈正比關(guān)系，大于5 mg時(shí)吸光度值反而下降，故最終確定供試品顯色時(shí)的取樣量在5 mg以內(nèi)，濃硫酸的用量為20 mL，并用10 mol/L的硫酸定容，此時(shí)測(cè)得的吸光度值最穩(wěn)定。

該研究結(jié)果可為美洲大蠊中抗肝纖維化活性提取物ML-D的質(zhì)量控制提供檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研發(fā)高效、低毒的抗肝纖維化新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 毛本勇）

Determination of Glycosaminoglycan in Active Extracts ML-D with Anti-hepatic-fibrosis from Periplaneta americana

LI Kuaqiao,LI Chunyan,YANG Yongshou,CHEN Lina,XIAO Peiyun*
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To establish a method for determining of glycosaminoglycan in active extracts ML-D with anti-hepatic-fibrosis from Periplaneta americana.Methods:Phenol-vitriol colorimetry was used for determining content of glycosaminoglycan;orthogonal design L9（34）was adopted to investigate hydrolysis process of glycosaminoglycan in ML-D;single factor experiment was used to investigate time of color,dosage of phenol and vitriolic.Results:For the best hydrolysis process of glycosaminoglycan in ML-D,the density of hydrochloric acid is 6 mol/L,Solid-liquid ratio is 1∶1,and time of hydrolysis is 1 h.There are the best conditions of color,the dosage of phenol and vitriolic respectively is 2 mL and 20 mL,heating time is 10 min.Conclusion:The method is simple and accurate with reproducibility;it can be used for the determining content of glycosaminoglycan in active extracts ML-D with anti-hepatic-fibrosis from Periplaneta americana.

Periplaneta americana；anti-hepatic-fibrosis；glycosaminoglycan；phenol-vitriol colorimetry；content determination

R931.71

A

1672-2345（2013）03-0009-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81060329）；云南省教育廳重點(diǎn)基金資助項(xiàng)目（2011Z053）

2012-11-20

2012-12-25

李夸巧，碩士研究生，主要從事藥物分析學(xué)研究. *通信作者：肖培云，教授.