產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌篩選方法的研究進(jìn)展*

侯亞文，易華西，楊艷艷，張?zhí)m威，馬放

1(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱，150090)2(哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱，150090)

近年來(lái)，利用乳酸菌對(duì)食品中一些腐敗菌和致病菌的抑制作用來(lái)加強(qiáng)食品安全性和延長(zhǎng)貯存期的生物保藏法逐漸被食品工業(yè)所重視［1］。乳酸菌在代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生許多抑菌物質(zhì)，其中細(xì)菌素(抗菌肽)是乳酸菌產(chǎn)生的一類分子質(zhì)量小、無(wú)毒、具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或多肽。隨著對(duì)細(xì)菌素作用機(jī)制及抗菌潛力的不斷挖掘，建立一個(gè)產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的快速、高效的高通量篩選平臺(tái)是目前國(guó)內(nèi)外面臨的技術(shù)難題。截至目前，細(xì)菌素的篩選多數(shù)來(lái)自發(fā)酵食物中的微生物菌群，而我國(guó)作為乳酸菌資源十分豐富的國(guó)家，為挖掘潛在的、具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型細(xì)菌素及乳酸菌菌株提供了重要渠道。除了nisin和pediocin PA-1之外，對(duì)其他乳酸菌細(xì)菌素還沒(méi)有進(jìn)行很好的大規(guī)模生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)性研究［2］。由于建立在乳酸菌生物信息學(xué)方面的基礎(chǔ)研究不斷發(fā)展，目前大多數(shù)快速篩選手段都是基于乳酸菌編碼細(xì)菌素的基因序列設(shè)計(jì)特定引物，利用PCR方法實(shí)現(xiàn)快速篩選［3］。該方法與傳統(tǒng)的瓊脂擴(kuò)散培養(yǎng)法相比，具有特異性強(qiáng)，大大縮短了篩選周期等優(yōu)點(diǎn)。本文比較綜述了目前已經(jīng)報(bào)道的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選方法，期望為我國(guó)乳酸菌細(xì)菌素的發(fā)掘乃至我國(guó)生物防腐劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 瓊脂擴(kuò)散法

瓊脂擴(kuò)散法是利用待檢測(cè)菌在瓊脂表面對(duì)指示菌的生長(zhǎng)顯示抑制效果的一種定性分析抑菌譜的篩選方法，是Tramer等人1964年建立起來(lái)的，適用于不透明、不能使用濁度分析法分析的樣品［4］。常用的杯碟法(well test)，濾紙片法(disc diffussion)和點(diǎn)種法(spot inoculation)均屬于此類方法。Wolf和Gibbons［5］對(duì)瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行了改進(jìn)，在培養(yǎng)基中加入吐溫20或吐溫80加快抗菌肽在瓊脂中的擴(kuò)散，提高了其靈敏度和準(zhǔn)確性。目前，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)產(chǎn)抗菌肽乳酸菌的篩選均建立在該方法的基礎(chǔ)上，Nabil Ben利用瓊脂擴(kuò)散法在當(dāng)?shù)匕l(fā)酵食品中進(jìn)行產(chǎn)抗菌肽乳酸菌的初篩，從135株乳酸桿菌篩選出31株產(chǎn)抗菌肽的乳酸菌，經(jīng)鑒定為28株植物乳桿菌和3株發(fā)酵乳桿菌［6］。Svetoslav利用瓊脂擴(kuò)散法從一種植物中分離出1株具有抗乳酸菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯氏菌、李斯特菌諾克(Listeria innocua)、李斯特菌伊萬(wàn)諾夫(Listeria ivanovii)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等致病菌的戊糖片球菌ST44AM，所產(chǎn)生的細(xì)菌素經(jīng)鑒定為片球菌素PA-1，它是一種ClassⅡ型細(xì)菌素［7］。胡淑敏利用的牛津杯雙層平板法也屬于此類篩選方法［8］，他從70株乳酸菌中篩選得到2株具有較高抑菌活性的乳酸菌LAB30和LAB211。黃新鳳(2009)等通過(guò)抑菌法從生牛奶中篩選出1株對(duì)多種G+細(xì)菌、G-細(xì)菌、酵母菌和絲狀真菌的乳酸乳球菌乳酸亞種菌株(Lactococcus lactis subsp.lactis)，并命名為 MB191［9］。

一種乳酸菌可能產(chǎn)生一種或多種細(xì)菌素，但由于最佳條件難以控制，很難兼顧細(xì)菌生長(zhǎng)活力和所產(chǎn)細(xì)菌素活力同時(shí)保持最佳狀態(tài)，或者篩選出了高產(chǎn)細(xì)菌素而無(wú)法發(fā)現(xiàn)其潛在的性能更加穩(wěn)定的細(xì)菌素。因而利用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行產(chǎn)抗菌肽乳酸菌篩選的同時(shí)還應(yīng)考慮培養(yǎng)基的優(yōu)化。李秀涼等人利用RSM法優(yōu)化了副干酪乳桿菌HD17產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基，找到了最大細(xì)菌素產(chǎn)生區(qū)域進(jìn)而確定了培養(yǎng)基最佳配方［10］。Amelia等人研究并評(píng)價(jià)了一些環(huán)境因素對(duì)植物乳桿菌17.2b產(chǎn)細(xì)菌素的影響，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌17.2b產(chǎn)細(xì)菌素的條件對(duì)環(huán)境條件十分敏感，與細(xì)菌生長(zhǎng)并沒(méi)有關(guān)系，細(xì)菌素產(chǎn)量達(dá)到最大時(shí)選擇次優(yōu)增長(zhǎng)溫度(suboptimal growth temperatures)，pH值選擇高于最適生長(zhǎng)時(shí)的pH值，不需要NaCl［11］。最近的研究表明，一些乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的能力除了與環(huán)境因素有關(guān)，還與培養(yǎng)基中NaCl濃度和有無(wú)表面活性劑有關(guān)。Castro等人發(fā)現(xiàn)發(fā)酵干腸中分離出的乳酸菌在冷藏條件下添加3%的NaCl，以及表面活性劑吐溫20和聚氧乙烯脂肪醇醚35，有利于乳酸菌產(chǎn)出熱穩(wěn)定性強(qiáng)的乳酸菌素［12］。

瓊脂擴(kuò)散法具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也具有準(zhǔn)確性、重復(fù)性差等缺點(diǎn)，很難作為高通量的篩選方法。本課題組將瓊脂擴(kuò)散法作為我們開(kāi)發(fā)的PCR快速篩選方法的輔助驗(yàn)證手段，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。目前雖然陸續(xù)有很多快速篩選方法的報(bào)道，但是瓊脂擴(kuò)散法仍然是國(guó)內(nèi)外最普遍使用的方法，還沒(méi)有出現(xiàn)一種篩選方法能完全代替瓊脂擴(kuò)散法。

2 微孔板生物測(cè)定法

微孔板生物測(cè)定法是Berridge和Barret在1952年提出的另一種基于抑菌活性的半定量篩選方法，基本原理是根據(jù)菌體濃度在一定范圍內(nèi)與透光度之間存在線性關(guān)系，確定存在線性關(guān)系的菌體濃度范圍(或透光度范圍)，從而建立起菌體濃度(Log10C)和透光度(T%)的線性關(guān)系［13］。Bhunia等人采用了96孔板法測(cè)定發(fā)酵上清液中細(xì)菌素的活性，其本質(zhì)是通過(guò)連續(xù)的梯度稀釋，找到最低抑制濃度或50%抑制濃度，然后以這個(gè)濃度作為任意單位，通過(guò)稀釋倍數(shù)來(lái)計(jì)算原溶液中細(xì)菌素的效價(jià)［14］。Turcotte等對(duì)這種多孔平板法作了改進(jìn)，對(duì)指示菌的濃度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，改變了多孔平板法作為一種半定量方法的局限性。研究表明，96孔板法的檢測(cè)極限(0.08～60 μg/mL)是瓊脂擴(kuò)散法(0.3 ～10 μg/mL)的 4 ～6倍［15］。

借助于酶標(biāo)儀，多孔平板法操作起來(lái)簡(jiǎn)便快捷、省時(shí)、省力以及精密準(zhǔn)確而使其在產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選方面被廣泛應(yīng)用。但是，筆者研究發(fā)現(xiàn)由于裝有指示菌液的多孔平板必須在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12～24 h，多孔平板孔洞中的菌液不可避免會(huì)揮發(fā)，在平板孔蓋上方容易產(chǎn)生水蒸氣，一方面改變了孔洞里的原始菌液體積，另一方面影響了比色結(jié)果，不能十分精確地測(cè)定細(xì)菌素的濃度;若稀釋倍數(shù)產(chǎn)生±1的偏差，會(huì)導(dǎo)致估算的原溶液細(xì)菌素的效價(jià)產(chǎn)生2倍甚至更大的偏差。后來(lái)對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，一方面在培養(yǎng)箱中墊放濕紗布或濕海綿盡量減少培養(yǎng)過(guò)程中菌液的揮發(fā)，同時(shí)在培養(yǎng)完畢后補(bǔ)加培養(yǎng)液，盡量減少誤差。

3 生物熒光法

生物熒光是活的生物組織體內(nèi)由于代謝活動(dòng)產(chǎn)生的一種發(fā)光現(xiàn)象。將編碼熒光素酶的基因克隆到指示菌中，可用于抗菌作用的敏感性檢測(cè)。利用細(xì)菌的熒光素酶基因克隆到金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等指示菌中，使得指示菌具有熒光酶基因luxAB和負(fù)責(zé)合成長(zhǎng)鏈脂肪醛的luxCDE基因，用于產(chǎn)生熒光，不需要外源性醛的加入就可以使熒光穩(wěn)定產(chǎn)生，無(wú)需平板計(jì)數(shù)和過(guò)夜培養(yǎng)就可以快速檢測(cè)出抗菌作用。該方法已經(jīng)用于檢測(cè)乳酸菌的抗菌作用［16］。另外，Norma等人研究了一種基于黃連素流入受損細(xì)胞后的熒光放射新型細(xì)菌素篩選方法［17］。黃連素是一種位于細(xì)胞內(nèi)的發(fā)熒光的生物堿，盡管這種特性的機(jī)制還不是很清楚，但它與生物分子包括DNA和葡糖胺多糖相結(jié)合時(shí)能發(fā)出熒光已經(jīng)得到確認(rèn)。黃連素分子量小于ATP，可以通過(guò)氣孔或者細(xì)胞質(zhì)膜破裂后進(jìn)入細(xì)胞［18-19］。鑒于此，由細(xì)菌素導(dǎo)致的細(xì)胞膜破壞會(huì)引起黃連素的細(xì)胞內(nèi)定位，同時(shí)使細(xì)胞發(fā)出熒光。因此，該方法的研究可以用來(lái)篩選作用機(jī)制為形成膜孔或破壞細(xì)胞膜完整性的產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌。

生物熒光法具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以在1～2 h內(nèi)得到結(jié)果。但這種方法的前提是必須先構(gòu)建含有熒光酶基因的基因重組指示菌菌株，技術(shù)要求較高，雖然從理論上這種方法可作為篩選產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的快速甚至高通量檢測(cè)方法，但由于指示菌種類(食品腐敗菌或致病菌)繁多，實(shí)際上不可能一一構(gòu)建所有的指示菌重組菌株，這種方法不適于用來(lái)篩選產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的乳酸菌。

4 基于PCR技術(shù)的快速篩選方法

隨著在世界范圍內(nèi)對(duì)不同乳酸菌菌株基因組測(cè)序的完成，基因組序列在挖掘新型高效的細(xì)菌素方面扮演著重要的角色，使得利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)和尋找新型細(xì)菌素成為可能。根據(jù)已知的細(xì)菌素DNA序列設(shè)計(jì)保守的PCR引物或制備寡核苷酸探針，可以在大范圍內(nèi)的乳酸菌群中挖掘出依賴功能性測(cè)定時(shí)不易發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌素［20］。其中，基于PCR方法的快速篩選可以作為生態(tài)學(xué)研究中的有效手段，可以鑒定出產(chǎn)細(xì)菌素的益生菌，并將其應(yīng)用在食品工業(yè)中。Michat等人基于class IIa型細(xì)菌素編碼基因，設(shè)計(jì)了編碼class IIa細(xì)菌素基因的7對(duì)引物，利用PCR方法從40種奶酪樣品中篩選出了產(chǎn)class IIa細(xì)菌素的乳酸菌［21］。Sunita等人用各種引物的PCR陣列鑒定出了LAB Bac+結(jié)構(gòu)基因，結(jié)果表明細(xì)菌素PCR陣列可以成功地?cái)U(kuò)增來(lái)自乳酸桿菌、乳球菌以及片球菌中的細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因［23］，該研究建立了一種微平板細(xì)菌素PCR陣列，可以快速擴(kuò)增細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因。另外，建立在PCR方法上的快速篩選還可以用來(lái)分析乳酸菌細(xì)菌素的基因簇多樣性，而基因簇的多樣性或操縱子的多態(tài)性可以反映細(xì)菌素是否具有廣譜抗菌性。Nabil等人利用PCR方法研究了已報(bào)道的產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌，對(duì)植物乳桿菌素操縱子的基因圖譜進(jìn)行了研究，用特定引物PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用于HindIII，EcoRI和KpnI的限制性群集分析，發(fā)現(xiàn)了植物乳桿菌C11中含有若干個(gè)植物乳桿菌素基因，而發(fā)酵乳桿菌EC11包含了plnDEFG基因簇［24］。我們課題組根據(jù)ClassⅡa抗菌肽N-端保守氨基酸序列(-YGNGVCXXXXCXV-和-LDNAIE-)這一特征設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，建立了基于 Colony-PCR法的產(chǎn)ClassⅡa抗菌肽乳酸菌的快速篩選方法，結(jié)合瓊脂擴(kuò)散法，能夠快速有效地從復(fù)雜的環(huán)境中分離出產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌［22］。

基于PCR技術(shù)的篩選方法具有靈敏、快速、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，目前被視為最有可能代替?zhèn)鹘y(tǒng)瓊脂擴(kuò)散法的方法，但由于所利用的特異性引物均為兼并引物，PCR擴(kuò)增很難避免非特異性產(chǎn)物，有時(shí)甚至出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物濃度高于特異性目標(biāo)產(chǎn)物，雖然我們?cè)谘芯恐袑?duì)引物和PCR反應(yīng)條件都進(jìn)行了優(yōu)化，但有時(shí)仍然會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物濃度過(guò)低難以回收的情況。究其原因，還是特異性靶點(diǎn)過(guò)少或特異性不強(qiáng)，需要進(jìn)一步增加特異性靶點(diǎn)挖掘的廣度和深度。隨著乳酸菌代謝產(chǎn)物及其編碼基因等生物信息的豐富，利用生物信息學(xué)方法從蛋白質(zhì)水平和基因水平進(jìn)一步挖掘特異性靶點(diǎn)，有望建立基于PCR技術(shù)的產(chǎn)ClassⅡa細(xì)菌素乳酸菌的高通量篩選模型，為構(gòu)建基于我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品宏基因組學(xué)的ClassⅡa抗菌肽高通量篩選平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。

5 其他方法

在過(guò)去的20多年中，許多新方法也被用來(lái)篩選產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，但由于存在的弊端和不足并沒(méi)有被廣泛應(yīng)用，例如基于多克隆或單克隆抗體的免疫學(xué)檢測(cè)方法ELISA，雖然該方法具有很高的靈敏性，但由于測(cè)定的結(jié)果與抗菌活力并沒(méi)有直接相關(guān)性，同時(shí)抗體與相關(guān)物質(zhì)的交叉反應(yīng)很難避免，所以依賴于抗體技術(shù)的免疫學(xué)檢測(cè)法還有待于抗體的改進(jìn)和發(fā)展。此外，如 ATP生物熒光法 (ATP-bioluminometry)［25］、輻射線法(radiometry)［26］、電導(dǎo)率測(cè)定法 (conductancemeasurement)［27］、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法 (capillary zonal electrophoresis)［28］、血細(xì)胞計(jì)數(shù)法 (flowcytometry)［29］也有報(bào)道。但是這些方法并沒(méi)有被廣泛地應(yīng)用，其原因主要是因?yàn)椴僮鲝?fù)雜、特異性不強(qiáng)，而且需要專用的儀器和設(shè)備。

6 展望

我國(guó)是一個(gè)乳酸菌資源十分豐富的國(guó)家，但對(duì)乳酸菌素的研究起步較晚，除nisin外，對(duì)其他乳酸菌細(xì)菌素還沒(méi)有進(jìn)行很好的基礎(chǔ)和開(kāi)發(fā)性研究。為了對(duì)細(xì)菌素活性及分離純化進(jìn)一步研究，尋找快速、有效的高通量篩選平臺(tái)至關(guān)重要，同時(shí)也成為目前如何獲取新型廣譜乳酸菌細(xì)菌素的瓶頸問(wèn)題之一。為了避免傳統(tǒng)瓊脂擴(kuò)散篩選方法篩選耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，近些年的研究多數(shù)建立在生物信息學(xué)方法的基礎(chǔ)上。由于乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素的分子量比較小，抗菌肽編碼基因的cDNA片段較小，通常僅有幾百bp，有的甚至只有幾十bp，給抗菌肽基因工程操作帶來(lái)極大困難［30］。另外，抗菌肽基因非常小，實(shí)驗(yàn)室一般的質(zhì)粒檢測(cè)和PCR檢測(cè)的方法對(duì)于驗(yàn)證表達(dá)載體很困難。對(duì)于上述難題，最新研究表明可通過(guò)基因重組的手段構(gòu)建雜合子，或者采用誘變育種的手段以期獲得新型的廣譜細(xì)菌素［31-32］。總之，隨著對(duì)乳酸菌基因組學(xué)的不斷發(fā)展和研究，基于生物信息學(xué)的PCR方法將成為快速發(fā)掘產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的主要方向和策略，將為開(kāi)發(fā)新型食品天然防腐劑奠定基礎(chǔ)。

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