馬兜鈴酸腎毒性的研究進展

彭金玲 邊育紅 王麗 李金奎

馬兜鈴酸為硝基菲類有機酸，主要由馬兜鈴酸A、B、C、D、E等及其衍生物組成。含馬兜鈴酸的中草藥達數十余種，主要存在于馬兜鈴科馬兜鈴酸屬、細辛屬，木通科木通屬,毛茛科鐵線蓮屬，防己科千金藤屬、蝙蝠葛屬，菊科川木通屬等[1]。馬兜鈴酸藥理作用廣泛,有抗感染、抗癌、增強細胞免疫及終止妊娠等功能[2-3]。長期以來，含有馬兜鈴酸的中藥材被廣泛應用于消化系統、泌尿系統、呼吸系統、心血管系統的多種疾病的治療。早在20世紀80年代，就有馬兜鈴酸毒性的報道。[4]近些年，隨著大量的臨床報道和實驗研究，馬兜鈴酸的腎毒性、致癌性和其他毒性作用陸續被發現，美國食品藥品管理局也在2000年5月相繼發布了兩個有關含有馬兜鈴酸植物藥物和食品的通告，并附有相關藥物的目錄，其毒性作用引起國內外學者廣泛關注。

1 化學結構

馬兜鈴酸是3,4-次甲二氧基-10-硝基-1-菲酸類化合物[5]，該類化合物結構十分相近，其碳骨架相同，僅是羥基、甲氧基和硝基在位置和數量上的不同，馬兜鈴酸及其各種衍生物的生理活性和毒性作用與這些結構上的變化有著密切的關系。如馬兜鈴酸I、馬兜鈴酸Ia和馬兜鈴酸II在結構上僅第8位碳上取代基不同，郭永超等[6]考察了這三類化合物對腎小管上皮細胞的毒性，結果表明在細胞形態學改變上馬兜鈴酸Ia、馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II對體外腎小管上皮細胞的貼壁生長的影響依次減弱，流式細胞術結果表明40 μg/ml馬兜鈴酸I、馬兜鈴酸II均引起細胞凋亡，而馬兜鈴酸Ia卻檢測不到凋亡。有文獻報道馬兜鈴酸的毒性與硝基、甲氧基和羥基有關，如出現硝基被還原、去甲基化和羥基的增加等變化均會降低馬兜鈴酸的毒性。因此，通過對馬兜鈴酸結構的分析，可以更好的了解其毒性的作用機制和體內代謝過程[7]。

2 腎毒性

馬兜鈴酸可以導致嚴重的腎臟損傷,臨床報道多見大劑量短期或者小劑量長期服用下導致腎臟急性或者慢性損傷,最終發展為腎衰竭。馬兜鈴酸引起腎臟損傷的主要特點是腎小管壞死,腎間質纖維化，對腎小球影響報到較少。

2.1急性毒性

臨床上多因患者單次或在較短的時間內服用大量含馬兜鈴酸的藥物而出現急性腎毒性，最終導致急性腎衰竭[7]。研究表明，雌、雄大鼠口服馬兜鈴酸的半數致死量(LD50)分別為183.9 mg/kg和203.4 mg/kg；靜脈注射分別為74.0 mg/kg和82.5 mg/kg。雌、雄小鼠口服馬兜鈴酸的半數致死量(LD50)分別為106.1 mg/kg和55.9 mg/kg；靜脈注射分別為70.1 mg/kg和38.4 mg/kg[8]。馬兜鈴酸的急性毒性除急性腎衰竭的癥狀外,往往同時伴有大劑量藥物對消化道或造血系統的一些中毒癥狀，如惡心、嘔吐、肝功能損害、甚至貧血和血小板減少等。劉金淵等[9]報告了1例因大量服用關木通水煎劑而至急性腎功能衰竭死亡的病例。李峰等[10]統計了30年國內部分文獻報告的13例木通中毒致急性腎功能衰竭的資料，發現口服木通煎劑120～200 g，1小時后即可出現頭昏、厭食、嘔吐、腰痛、全身乏困等急性腎功能衰竭的癥狀，病情發展快且恢復緩慢。

2.2馬兜鈴酸腎病

臨床上根據損傷表現以及腎臟病理改變的不同，可將馬兜鈴酸腎病分為三種類型[11-14]：急性馬兜鈴酸腎病、慢性馬兜鈴酸腎病以及腎小管功能障礙型馬兜鈴酸腎病。

急性馬兜鈴酸腎病多由在較短的時間內，大量服用含有馬兜鈴酸的藥物所致，臨床表現主要為少尿或非少尿性急性腎功能衰竭。其他癥狀如消化道、血液系統中毒癥狀、肝功能損害及神經系統異常等。病理表現為急性腎小管壞死，部分腎小管僅殘留裸露基底膜，腎間質水腫，小動脈內皮細胞腫脹。

慢性馬兜鈴酸腎病多由持續或間斷小劑量服用含馬兜鈴酸藥物所致，有腎性糖尿及輕度蛋白尿、低比重尿及低滲透壓尿，腎功能呈進行性損害。并常伴貧血、高血壓等癥狀。主要病理表現為寡細胞性慢性腎間質纖維化。可見腎間質呈多灶或大片狀纖維化，腎小管萎縮或消失，腎小球基底膜呈缺血性皺縮。

腎小管功能障礙型馬兜鈴酸腎病通常在間斷小量服用含馬兜鈴酸藥物后數月出現癥狀，主要表現為腎小管性酸中毒和/或范可尼綜合征，同時伴濃縮功能障礙，而血清肌酐及尿素氮基本正常，病理改變主要為腎小管變性及萎縮，部分崩解脫落。電鏡下可見腎小管刷狀緣部分脫落，上皮細胞線粒體腫脹，部分細胞器崩解及脫落，腎小球基本正常。

2.3致癌性

目前研究顯示，馬兜鈴酸不僅有明顯的腎臟毒性，而且有顯著的泌尿系統致癌作用，特別是容易引起尿路上皮惡性腫瘤。20世紀80年代就有馬兜鈴酸可導致大鼠腎盂及膀胱移行細胞癌的報道。王樹祥等[15]對河南省南陽市中心醫院腎內科近8年的相關病例進行了回顧性分析，結果表明慢性馬兜鈴酸腎病組惡性腫瘤發生率達22.22%，尤其是泌尿系惡性腫瘤發生率達19.44%，明顯高于對照組。周穎等[16]報道，在279例腎移植患者中，23例患者服用過含馬兜鈴酸的中藥，其中15例腎移植術后繼發腫瘤，發生率65.2%。256例患者未服過含馬兜鈴酸中藥，有3例患者腎移植后繼發腫瘤，發生率為1.2%。結果顯示服用含馬兜鈴酸中藥患者腎移植術后繼發腫瘤的風險增加。

3 馬兜鈴酸腎毒性作用機制

3.1內質網應激反應

內質網應激反應是馬兜鈴酸腎毒性機制的一種新學說。研究表明內質網應激反應是細胞的一種自我保護性機制，適度的內質網應激可以恢復內質網及內環境的穩態、保持細胞活性，對細胞具有保護作用，但是過強或過長時間的內質網應激可以誘導一系列細胞因子的大量釋放并最終導致細胞凋亡[19]。Zhu等[20]研究發現馬兜鈴酸作用于人腎小管上皮細胞后可增強真核細胞翻譯啟始子-2α(eIF2a)磷酸化；增加XBP1 mRNA剪接；GRP78和CHOP基因表達上調，這些變化都是典型的內質網應激反應所涉及的通路。用4-苯丁酸鈉(4-PBA)或者是Sal前處理可以顯著抑制馬兜鈴酸所引起的凋亡，這一結果反映了內質網應激反應在馬兜鈴酸引起的細胞凋亡中的重要作用。進一步研究表明，用NAC或是GSH前處理可以顯著減少內質網應激反應相關蛋白的含量并且減少細胞死亡，由此得出馬兜鈴酸可能是通過內質網應激反應引起細胞凋亡。這一結果為馬兜鈴酸腎毒性機制提供了新實驗依據。

3.2氧化應激

機體的氧化應激反應與多種疾病的發生、發展有關，當氧化應激發生時，體不能及時清除升高的細胞活性氧，進而引起脂質過氧化升高、DNA氧化損傷及細胞凋亡等損害[21]。季文萱等[22]采用馬兜鈴酸20 mg/ml刺激培養HK-2細胞48小時，結果發現與對照組比較，馬兜鈴酸組HK-2細胞活性顯著抑制，細胞凋亡比例明顯增加，SOD、GSH-PX活力明顯下降，MDA含量明顯增加，這一結果表明馬兜鈴酸誘導HK-2細胞凋亡的機制與其導致的氧化應激損傷有關，馬兜鈴酸可降低HK-2細胞的抗氧化酶活性，導致氧化應激明顯增強，造成脂質過氧化。因此，氧化應激作用可能為馬兜鈴酸腎病的發病機制之一。李振雪等[23]采用彗星實驗檢測腎組織中的DNA鏈斷裂程度并利用免疫組化檢測8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)表達情況，結果表明含馬兜鈴酸中藥可致腎組織活性氧增高，進而引起DNA氧化性損傷。

3.3DNA損傷

馬兜鈴酸在體內可以通過硝基還原代謝生成馬兜鈴內酰胺，并在一系列酶如微粒體酶類、胞質酶和NADPH(醌氧化還原酶)等的作用下與DNA形成馬兜鈴酸-DNA加合物，導致細胞損傷，并促進腎間質纖維化過程的發生，因此該加合物在腎臟蓄積也可能是馬兜鈴酸腎毒性機制之一[24]。體外研究發現[25]，馬兜鈴酸與腎小管上皮細胞共培養14小時后即可出現馬兜鈴酸-DNA加合物。體內研究顯示，大鼠灌胃給予馬兜鈴酸后可引起蛋白尿、NAG升高等腎損傷癥狀，應用LC-MS對大鼠腎臟進行分析，結果發現在一次口服給予馬兜鈴酸5 mg或30 mg/kg體重后大鼠的腎臟均可檢測出脫氧胞苷-DNA加合物、脫氧腺苷-DNA加合物，而脫氧鳥苷-DNA加合物只有在口服給予30 mg/kg體重的大鼠腎臟才能被發現。在臨床報道中也發現在馬兜鈴酸病人的腎臟組織中檢測到馬兜鈴酸-DNA加合物，說明馬兜鈴酸的腎毒性可能與馬兜鈴酸-DNA加合物有關[26]。另外，脫氧腺苷-DNA加合物可以引起基因A-T突變[27]，使原癌基因ras突變進而活化，而抑癌基因p53也因突變而失去活性，最終使細胞增殖分化異常，并引起腫瘤的發生。

3.4免疫炎癥機制

馬兜鈴酸腎病腎臟病理改變的特點包括間質寡細胞浸潤纖維化[28]，文獻報道在馬兜鈴酸腎病大鼠實驗模型中發現有炎性細胞浸潤，表明馬兜鈴酸腎病的發病可能伴隨炎性反應過程，所以推測免疫反應可能是馬兜鈴酸腎病的發病機制之一[29]。孫建新[30]應用大劑量馬兜鈴酸建立小鼠馬兜鈴酸腎病模型，表現為早期急性腎損傷，后發展為腎小管間質纖維化。該模型存在免疫功能紊亂，表現為全身淋巴細胞亞群紊亂，腎小管間質中CD3+T淋巴細胞的浸潤及腎小管細胞共刺激分子CD40的上調性表達。Pozdzik等[31]用大鼠馬兜鈴酸腎病模型研究表明近端腎小管壞死區域有單核/巨噬細胞和T淋巴細胞的浸潤。這些研究提示免疫炎癥機制可能參與了馬兜鈴酸腎病的發生發展。

3.5凋亡機制

馬兜鈴酸可作用于腎小管上皮細胞，造成腎小管上皮細胞的凋亡和損傷。其對腎小管上皮細胞有明顯的細胞毒性損害作用,使細胞超微結構發生顯著損傷性改變, 出現核分葉、巨核、核染色質濃染、核邊集、核缺失；核膜卷曲增厚、線粒體腫脹等嚴重細胞損傷改變[32]。體外實驗發現，20～40 μg/ml濃度的馬兜鈴酸可明顯抑制人近端腎小管上皮細胞的增殖，較高濃度的馬兜鈴酸(40 μg/ml)可明顯刺激細胞凋亡；80 mg/ml和160 mg/ml濃度的馬兜鈴酸對HK-2細胞有明顯細胞毒性作用[33]。Li等[34]研究發現馬兜鈴酸對HK-2細胞的增殖抑制作用呈現濃度-時間依賴關系，細胞凋亡主要發生在G1高峰，該過程依賴caspase3途徑的介導。

3.6腎小管上皮細胞轉分化

轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β途徑的激活是馬兜鈴酸引起腎間質纖維化的重要機制之一。馬兜鈴酸可激活腎小管上皮細胞，分泌大量TGF-β，促進纖溶酶原活化抑制劑-1和金屬基質蛋白組織抑制因子-1mRNA的表達，誘導纖連蛋白的分泌，進而導致間質纖維化的發生[35]。體外研究發現馬兜鈴酸作用于小鼠腎小管上皮細胞后可促進TGF-β1、α-平滑肌肌動蛋白表達增加，α-平滑肌肌動蛋白是肌成纖維細胞激活的指示性標志物，說明馬兜鈴酸可誘導腎小管上皮細胞轉分化成肌成纖維細胞。進一步研究發現50 ng/ml馬兜鈴酸作用于腎小管上皮細胞后可引起Smad2表達增加、300 ng/ml馬兜鈴酸作用腎小管上皮細胞后可引起Smad7表達下降，使用特異性TGF-β1受體拮抗劑可降低馬兜鈴酸誘導的腎小管上皮細胞轉分化。進一步證明了TGF-β1信號途徑參與了馬兜鈴酸誘導的上皮細胞轉分化過程[36]。臨床實驗中也可見類似的報到，Yang等[37]在馬兜鈴酸腎病患者腎臟病理活檢標本中發現TGF-α、結締組織生長因子、細胞外基質成分和纖連蛋白等表達均有增加，這表明馬兜鈴酸腎病患者腎小管上皮細胞轉分化和由此引起的細胞外基質沉積可能是馬兜鈴酸引發的腎間質纖維化的重要機制。牛效清等[38]選取了30例年齡在25～75歲的馬兜鈴酸腎病患者，并用20例健康成人作對照，采用ELISA法測定血清TGF-β1及BMP-7水平。結果發現與對照組相比病例組TGF-β1顯著增高,BMP-7顯著降低，且TGF-β1與BMP-7呈負相關。這說明TGF-β1、BMP-7相互間調節作用是慢性馬兜鈴酸腎病發病機制中的重要環節之一。通過調節該平衡作用將延緩腎間質纖維化的進展。馬兜鈴酸抑制BMP-7mRNA的表達的作用，還將使腎小管再生修復能力下降，加重腎損傷[33]。因此，明確腎小管上皮細胞轉分化作用機理將為臨床治療馬兜鈴酸腎病提供了一個新的治療靶向。

3.7缺血學說

馬兜鈴酸可以損傷腎小血管壁，出現管壁增生、增厚，管腔狹窄，引起缺血，特別是間質的慢性缺血，最終導致小管萎縮及間質纖維化。血管內皮生長因子是具有促進內皮細胞增殖，增加血管通透性、血管生成并維持功能的生長因子；缺氧誘導因子-1是目前發現的一個特異性缺氧狀態下發揮活性的轉錄因子是細胞低氧的可靠標記物，Wen等[39]通過這兩個指標的變化考察缺血對馬兜鈴酸腎病的影響，實驗采用灌胃給予小鼠馬兜鈴酸20 mg/kg，腎小管損傷評分在第4天和第8天均顯著增加，而血管內皮生長因子的表達在第4天和第8天顯著減少，缺氧誘導因子-1α在腎臟間質表達顯著增加，這一結果提示缺血可能與馬兜鈴酸腎病的病理密切相關。對于急性馬兜鈴酸腎病也可得到類似的結果，張林等[40]采用關木通水煎劑60 g/(kg·d)連續灌胃5天制作急性馬兜鈴酸腎病模型，在造模后第3～7天與對照組比較血管內皮生長因子表達逐漸降低，第5天和第7天的缺氧誘導因子明顯表達，說明腎組織存在明顯缺血缺氧狀況，這一狀況在腎臟微血管損傷中起非常重要的作用。

3.8代謝酶與腎損傷

研究發現多種酶參與了馬兜鈴酸在體內的代謝和致病過程。馬兜鈴酸由多種硝基菲羧酸化合物組成，其中主要含有馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II兩種化合物，其中前者是馬兜鈴酸主要的毒性成分，氧化代謝是馬兜鈴酸I體內代謝的重要過程，P450、CYP1A1和CYP1A2等都是催化馬兜鈴酸I發生氧化反應的代謝酶，氧化代謝后的產物馬兜鈴酸Ia可由尿液和糞便中排出[41-43]。還原代謝是體內代謝馬兜鈴酸I的另一個重要過程，NQO1、CYP1A1/2等是體外還原馬兜鈴酸I重要的代謝酶[42,44]。馬兜鈴酸I經還原代謝后生成的產物能與DNA共價結合生成馬兜鈴酸I-DNA加合物，誘發p53基因突變并導致腫瘤的發生[45]。Katerina Levova等[46]運用Cyp1a1(-/-)，Cyp1a2(-/-)和Cyp1a1/1a2(-/-)基因敲出小鼠，考察馬兜鈴酸對自身硝基還原酶的影響，研究發現馬兜鈴酸預處理后基因敲出的小鼠腎臟肝臟NQO1蛋白表達和酶活性與野生型有顯著差異。進一步研究發現NQO1酶活性還與馬兜鈴酸I的生物活性有關，NQO1酶活性升高可以提升馬兜鈴酸I-DNA加合物的水平，因此，馬兜鈴酸可能是通過提高自身代謝酶NQO1活性，進而引起腎毒性和遺傳毒性。

4 結語與展望

綜上所述，馬兜鈴酸雖具有多種藥理作用，但其腎毒性和致癌性等毒性作用嚴重阻礙了含有馬兜鈴酸成分中藥的發展。目前對于馬兜鈴酸的毒性作用的研究，除了傳統觀點的腎間質纖維化、腎小管上皮細胞損傷、腎血管壁缺血和致癌作用以外，分子生物學機制也逐漸被人們發現，免疫炎癥機制、內質網應激反應、氧化應激反應、TGF-β途徑和代謝酶都與馬兜鈴酸引起的腎臟損傷有關。因此對于這一類藥物要嚴格控制用藥劑量和服用周期，避免大量或長時間服用，對于藥物的來源應嚴格把關，防止因原植物藥的混用而造成中毒。對于馬兜鈴酸毒性機制的不斷研究，設計安全有效的藥用劑型,并運用現代分析方法建立和完善控制制劑質量的標準, 將使該藥在臨床上得到更廣泛應用。

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