外源siRNA誘導家蠶先天免疫應答

何漸鳴 王明慧 毛鈺霞 沈衛德，3 許雅香，3*

(1蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123;2現代絲綢國家工程實驗室;3蘇州大學蠶桑研究所)

RNAi是由雙鏈RNA引發的序列特異性基因沉默現象［1］，可高效、特異地沉默特定基因。這是個應對病毒感染或dsRNA結構分子進化保守的防御應答機制，除RNAi外，病毒或dsRNA也能觸發別的免疫應答途徑［2］。

昆蟲有一個高效的先天免疫系統來區別異己成分和消除外源入侵物。先天性免疫應答系統產生的抗菌肽可以對微生物感染作出迅速有效的免疫應答［3，4］。LPS 是眾所周知的病原體相關分子模式(PAMP)，能引起昆蟲的先天免疫應答，而siRNA作為外源物質，是否也被當做異物識別，發生免疫應答反應，至今鮮見報道。

在這個研究里，我們報道了家蠶在 LPS和siRNA誘導后黑化作用相關基因的轉錄水平，相關基因表達量的相似說明siRNA在家蠶先天免疫應答中也能充當PAMP。

2 材料和方法

2.1 材料

家蠶品種為本研究室保存的大造，正常桑葉育。LPS購自Sigma公司，Trizol RNA提取及M-MLV反轉錄試劑及其它化學常規試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

2.2 方法

2.2.1 家蠶幼蟲注射有效siRNA及LPS

取5齡第4天幼蟲，實驗組每頭家蠶幼蟲注射10μL LPS(150mmol/L NaCl溶解，終濃度1mg/mL)，對照組每頭幼蟲注射10μL 150mmol/L NaCl。分別在注射后9h取實驗組和對照組幼蟲的血淋巴。每組至少取10頭家蠶幼蟲。

將適量的siRNA溶于不含有RNA酶的無菌水中，輕輕混勻，siRNA為10μg/μL。取5齡第4天幼蟲，實驗組每頭家蠶幼蟲注射10μL siRNA，對照組每頭幼蟲注射10μL無菌水，分別在注射后24h后取實驗組和對照組的血淋巴，每組至少取10頭家蠶幼蟲。

2.2.2 樣品制備

取5齡第4天幼蟲，在冰上剪腹足取血淋巴，－80℃冷凍保存。

2.2.3 RNA提取和反轉錄PCR(RT-PCR)

用Trizol(TaKaRa公司)試劑盒說明書分別提取組織總RNA，用M-MLV反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)反轉錄為為cDNA。

2.2.4 PO活性分析

LPS 注射后 3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h 取家蠶的血淋巴，PO活性檢測用L-多巴作為底物，固定波長490nm。取96孔U形板，在每個微孔內加入28℃下預溫育的300μL 0.1mol/L PH=6的磷酸鹽緩沖液，10μL 0.01mol/L 的 L-多巴及10μL 血清，酶標儀震蕩4次，立即測反應體系的吸光值，每隔2min讀一次吸光值，共10次。

2.2.5 基因表達分析

采用Primer 5.0軟件，引物如表1所示。采用SYBR PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒測定具體步驟按照說明書進行，反應程序為:95℃預變性1 min，95℃變性15s，60℃退火30s，循環45 次。

表1 實時熒光定量PCR反應體系

反應過程由ABI7300熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)軟件自動設定，每個樣品重復3次。

表2 實時熒光定量PCR的檢測基因和內參照基因的引物

3 結果

3.1 血淋巴PO活性分析

在用LPS處理后檢測家蠶幼蟲血淋巴的PO活性，結果顯示LPS處理后PO活性是先升高再降低，PO活性在LPS處理后的3h、6h、9h后上升，9h時活性最高，PO活性在12h時開始降低，在18h時PO活性降到初始水平，見圖1。

圖1 LPS誘導不同時間后PPO活性變化

3.2 基因表達

LPS誘導和siRNA片段干擾后各基因的表達如圖2、3所示。

在用 LPS 誘導后 9h，Bmβ-1，3-GRPB2，Bm-PAEE，Bmserpin-3的表達量是上升的，而BmβGRP1，BmPPO2，BmDDC的表達量則下降，見圖2。

圖2 LPS誘導9h后各基因的mRNA相對表達量

在用siRNA片段干擾后24h，BmPPAE，Bmserpin-3 的表達量呈上升，而 BmβGRP1，Bmβ-1，3-GRPB2的表達量則下降，BmPPO2，BmDDC的表達量略下降，見圖3。

圖3 RNA干擾24h后各基因的mRNA相對表達量

4 討論

在哺乳動物里，dsRNA被認為是以病毒的分子模式引起先天免疫［5，6］。人類 TLR3作為激活 NF-kB途徑的dsRNA的PRR，生產Ⅰ型干擾素(IFN-a/b)［7，8］。在昆蟲方面，dsRNA 作為一個蛋白觸發先天免疫反應鮮為人知，而siRNA與dsRNA相似，猜想是否siRNA也能觸發昆蟲的先天免疫。

siRNA廣泛用于RNAi導致基因沉默。在鱗翅目昆蟲中，RNAi效率在不同物種、組織、時期和靶基因顯示相當多的變化［9］。我們的研究表明siRNA可以影響免疫相關基因的表達，或許可以解釋鱗翅目昆蟲RNAi的可變性之多。

LPS是眾所周知的病原體相關分子模式(PAMP)，能引起昆蟲的先天免疫應答，在用LPS誘導后，與模式識別受體(PRRS)相結合，進而激活免疫系統，如多酚氧化酶級聯(PPO)反應，我們先檢測LPS誘導后PPO的活性，發現其活性升高，推測可能參與黑化作用。

我們推測siRNA引起的免疫反應與LPS類似，因而檢測參與黑化作用的3類分子［10］，即識別分子，信號分子和效應分子相關基因表達量的變化。結果顯示，作為識別分子的 BmβGRP1，Bmβ-1，3-GRPB2，siRNA片段誘導后都下降，而LPS誘導后Bmβ-1，3-GRPB2上升，BmβGRP1 略下降，結果的不同可能是因為兩者都是針對于革蘭氏陰性菌的識別因子，而siRNA片段不屬于此類，作為信號(調節)分子的 BmPPAE，Bmserpin-3，siRNA片段和 LPS誘導后都上升，作為效應分子 BmPPO2，BmDDC，siRNA片段和LPS誘導后都下降，但LPS誘導后下降幅度大。由此可知，兩種方式誘導后，各基因的表達模式基本相似，說明siRNA在家蠶先天免疫應答中也能充當PAMP。

［1］Yang M，Mattes J.Discovery biology and therapeutic potential of RNA interference，microRNA and antagomirs［J］PharmacolTher，2008，117(1):94 －104.

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［3］許平震.家蠶先天免疫的模式識別信號傳導和抗微生物肽基因表達調控機制研究［D］，2010重慶:西南大學.

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［7］Alexopoulou L，Holt AC.Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3.［J］Nature 2001，413，732-738.

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［10］楊松.昆蟲黑化反應的分子機制研究進展［J］2003，30(4):164－168.