CaMKⅡ在神經缺血性損傷中的作用

李海濤，李玉明

(首都醫科大學燕京醫學院，北京 101300)

鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)，為Ser/Thr蛋白激酶CaMKS家族中多功能酶成員，廣泛分布于神經組織，參與調節突觸傳遞過程，形成長時程增強(LTP)，是介導學習和記憶的關鍵物質。此外，CaMKⅡ還具有調節靶基因轉錄等多種功能。腦缺血損傷的機制復雜，涉及興奮性氨基酸毒作用、鈣離子超載及氧化應激生成自由基等因素。在腦缺血損傷的病理過程中，CaMKⅡ起著極為關鍵的作用。本文對CaMKⅡ在神經缺血性損傷中的作用進行綜述。

1 CaMKⅡ生物特性

CaMKⅡ是一種多功能蛋白激酶，在海馬和皮層中表達較高，約占海馬總蛋白的2%;神經元的胞體和樹突中CaMKⅡ含量最高，其次是神經末梢。電鏡下發現，CaMKⅡ主要定位于漿膜、線粒體和突觸后顆粒(PSD)。CaMKⅡ分子由 α、β、γ、δ 4種亞單位構成，每種亞單位均有單獨的基因編碼。序列分析顯示，CaMKⅡ分子中包含有1個位于N末端的接觸催化區、1個調節區、1個可變序列和1個位于C末端的亞基偶聯區。其中調節區又由自身抑制域、鈣調素結合域和自身磷酸化位點組成。當Ca2+/CaM缺乏時，CaMKⅡ調節區的自身抑制域和催化區相結合，從而阻止了底物蛋白和催化區結合，CaMKⅡ處于非激活狀態;當Ca2+/CaM復合物形成時，其作用到CaMKⅡ結合區，使CaMKⅡ分子構象發生改變，使鄰近亞基的結構域發生T286磷酸化，自身抑制區失活，CaMKⅡ被活化，這一過程為Ca2+依賴性磷酸化;與此同時，T286磷酸化進一步催化酶自身磷酸化位點(T305/306)磷酸化，因而當Ca2+缺乏時，催化區處于持久活化狀態，催化底物磷酸化，酶的這種不依賴Ca2+的自身磷酸化激活稱為自身磷酸化。具備兩種激活方式是CaMKⅡ的獨特特征［1］，其中自身磷酸化涉及細胞損傷機制［2］。

2 CaMKⅡ與缺血性神經損傷

2.1 神經缺血損傷過程中CaMKⅡ活性變化 在生理情況下，腦組織中CaMKⅡ水平低，但足以維持細胞內正常生化反應需要和正常的突觸信息傳遞。短暫腦缺血激活CaMKⅡ，表現為CaMKⅡ磷酸化水平升高，急性嚴重腦缺血，CaMKⅡ磷酸化水平及蛋白表達均降低［3］。永久性結扎大鼠雙側頸總動脈，檢測出缺血2周CaMKⅡ活性呈現為先升高后降低，最后顯著低于正常的變化過程［4］。

2.2 CaMKⅡ與興奮性毒性 興奮性毒性是神經缺血損失的原因之一，腦缺血觸發神經元缺氧去極化，解除了Mg2+對N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)抑制，同時，腦缺血過程中，谷氨酸的濃度升高，過度激活NMDAR受體和AMPA受體(AMPAR)誘發Ca2+超載，高濃度的Ca2+激活了細胞凋亡和壞死信號通路，而CaMKⅡ恰是興奮性毒性-Ca2+超載—細胞損傷通路中關鍵性酶，因此，CaMKⅡ及其底物變化涉及缺血性神經損傷［5］。

2.3 CaMKⅡ自身磷酸化與神經缺血損傷 在大腦中動脈阻斷(MCAO)模型和原代培養的小鼠大腦皮層細胞上證實，用特異性抑制CaMKⅡ活性的肽tatCN21、tatAIP抑制Ca2+依賴的磷酸化和自身磷酸化，可明顯減輕谷氨酸所致的神經元損傷，這種保護效應即使在皮層細胞損傷發生2 h之后，應用tatCN21仍然出現;而傳統的CaMKⅡ抑制劑KN93只在損傷刺激存在期間具有神經保護作用，隨著損傷刺激結束，其保護作用消失。這是因為KN93不能抑制損傷刺激誘發的CaMKⅡ自身磷酸化，而tatCN21和tatAIP不僅可以抑制Ca2+依賴的磷酸化，還可以抑制CaMKⅡ自身磷酸化。CaMKⅡ自身磷酸化被認為是恢復血流后細胞損傷的重要機制之一，提示抑制CaMKⅡ自磷酸化可能是啟動腦缺血損傷保護作用更為重要的靶點。同樣，CaMKⅡ自磷酸化缺失的基因突變體T286A小鼠，較CaMKⅡ過度表達的野生型小鼠，更能耐受谷氨酸興奮毒性［2］。然而，Waxham 等［6］發現，缺血時 CaMKⅡ基因敲除小鼠比野生型小鼠腦梗塞面積大2倍，提示，盡管抑制CaMKⅡ活性可保護細胞，但CaMKⅡ的完全消失對缺血后細胞的生存卻是致命的。低水平CaMKⅡ活性對缺血后神經元功能的維持可能是至關重要的。

2.4 CaMKⅡ-PSD-95-GluR6復合體與腦缺血損傷 CaMKⅡ的活性異常是引發腦缺血再灌損傷的重要因素之一，這與興奮性突觸后密集區相關蛋白(PSDp)介導的突觸后信號通路的激活有關。位于興奮性突觸后密集區(PSD)的相關蛋白主要有CaMKⅡ、PSD-95和GluR6等，是在興奮性突觸后密集區中純化鑒定出的一種腳手架蛋白。通過其蛋白分子中的PDZ(1-3)、SH3和GK結構域，PSD-95可募集多種信號分子，在谷氨酸受體的信號整合和轉導中起關鍵作用［7］。

腦血管結扎腦缺血再灌注時，谷氨酸釋放激活CaMKⅡ，活化的CaMKⅡ易化CaMKⅡ-PSD-95-GluR6復合體的形成，促使GluR6的絲氨酸磷酸化，進一步激活JNK信號傳導通路，進而導致細胞的死亡，即谷氨酸的興奮性毒性作用。Liu等用CaMKⅡ的反義核苷酸抑制CaMKⅡ的表達，減輕了缺血再灌注3～5 d的大鼠海馬CA1區神經元的凋亡，進一步提示CaMKⅡ蛋白量的增高及與突觸后密集區相關蛋白的相互作用在腦缺血再灌損害中的作用［8，9］。

2.5 CaMKⅡ激活介導缺血性神經損傷的機制 盡管通過抑制CaMKⅡ自磷酸化可以減輕缺血后細胞死亡的研究結果很多，這些研究也證實了CaMKⅡ自磷酸化引起的異常激活與缺血性神經細胞的損傷有關，但其確切機制仍不十分清楚。目前認為，可能與CaMKⅡ誘發的促細胞死亡因素的活性被削弱有關。與CaMKⅡ激活有關的促進細胞死亡的因素包括:①缺血壞死與凋亡相關的AMPA受體。AMPA受體(GluR1 S831)磷酸化后其電導增加，進而誘發致死性的Ca2+超載。與GluR1基因等效的AMPA受體，其活化后比介導Ca2+內流的GluR2受體具有更明顯的致細胞死亡的效應［10］。②VDCCs通道激活。CaMKⅡ通過易化或增強VDCCs通道，進一步加重Ca2+超載［11］。③細胞間的連接蛋白穩定性降低。CaMKⅡ直接作用于細胞間的連接蛋白，破壞腦組織的內環境穩態，使神經元與膠質細胞之間信息與物質的交流減少，最終引起細胞死亡［12］。④質子敏感的離子通道被激活。通過磷酸化質子敏感的離子通道，增強缺血激活離子通道的活性，也是CaMKⅡ引起神經細胞死亡的原因之一［13］。⑤CPEB4向胞核轉位。最近研究發現，CaMKⅡ激活誘發的CPEB4由胞質穿梭至胞核，啟動細胞內原性損傷機制，是CaMKⅡ介導的缺血性神經細胞死亡的又一通路。CPEB4基因敲除同樣導致神經元死亡;通過導入該基因使其重新表達，則可阻斷或逆轉細胞的死亡。CaMKⅡ異常激活所致的細胞核CPEB4積聚或向核內轉位可能是CaMKⅡ介導的缺血性神經元死亡的機制之一［14］。

3 CaMKⅡ膜轉位在腦缺血性損傷保護中的作用

生理情況下，絕大部分CaMKⅡ作為可溶性成分存在于胞質中，其余小部分存在于膜相結構中。腦缺血15 min后，大鼠皮層和海馬的膜相成分中CaMKⅡ增加50%，提示缺血促進了CaMKⅡ由胞質向胞膜轉位，這種轉位與PKC的不可逆膜轉位不同，短暫缺血所致的CaMKⅡ在胞質和胞膜之間的轉位是可逆的。短暫缺血后，胞質CaMKⅡ活性仍然可以被檢測，但CaMKⅡ mRNA明顯降低，表達的下降，及膜轉位引起的胞質CaMKⅡ活性進一步下調［15］。

腦缺血后谷氨酸的釋放，作用到NMDA受體，引起Ca2+內流，最終導致CaMKⅡ兩個方向的轉位。首先是向突觸后膜和突觸外簇的轉位。生理情況下，谷氨酸刺激誘發CaMKⅡ向突觸后膜轉位，并與幾種突觸蛋白結合，維持突觸正常形態及可塑性，參與學習與記憶過程;病理情況下，谷氨酸刺激和缺血狀態，使CaMKⅡ轉移到突觸膜，與幾種突觸蛋白特別是GluN2B(NR2B)結合，形成一種非溶解狀態的復合物介導突觸蛋白的凝聚［16，17］。上述兩種類型的轉位皆需經由CaMKⅡ T位點的蛋白相互作用。CaMKⅡ與突觸蛋白的聚集需pH低于6.8的環境條件，腦缺血時局部酸中毒可能有利于這種聚集，其詳細分子機制尚不十分清楚，目前認為可能與自磷酸化時α螺旋鉸鏈的282位組氨酸質子化有關［18］。

腦缺血過程中，Ca2+/CaM誘發的CaMKⅡ轉位或聚集使其在胞質中的活性降低，進而減輕胞質CaMKⅡ異常激活引起的細胞損傷。推測CaMKⅡ的移位和聚集可能是缺血時細胞啟動內源性保護性機制的方式之一。

4 適當濃度的CaMKⅡ對缺血性腦損傷具有保護作用

Ashpole等［5］將海馬神經元暴露于谷氨酸的興奮毒性作用，并在暴露前、后短時間應用KN-93、tat-AIP及tat-CN21等CaMKⅡ抑制劑，發現抑制CaMKⅡ異常激活可降低海馬神經元的死亡率。雖然抑制CaMKⅡ過度激活可產生保護作用，但持續抑制CaMKⅡ活性超過8 h后，保護作用丟失，細胞死亡率反而升高。過度抑制CaMKⅡ的活性得到相反的結果，這些研究提示，維持胞質中CaMKⅡ一定程度活性對細胞生存至關重要。

適量活化的CaMKⅡ通過以下4個方面的機制減輕細胞的損傷:①CaMKⅡ通過磷酸化nNOS，抑制其活性，降低一氧化氮合成酶(nNOS)誘發的神經元損害。盡管谷氨酸的釋放會產生一定程度的興奮性毒性，但恰當濃度的CaMKⅡ通過谷氨酸激活NMDA受體，可分解nNOS，減少NO的產生，減輕自由基對神經細胞的損傷［19，20］;②CaMKⅡ可通過調節某些離子通道減輕興奮性毒性作用對神經元的損傷。如:磷酸化GluN2B受體(ser1303)，促進興奮性效應的 NMDA受體脫敏，增強抑制性效應的GABAα受體表達，從而減輕神經元的興奮性毒性作用;③恰當濃度的CaMKⅡ和CaMKIV可以激活具有細胞保護作用的蛋白如ErK和ScrB，同時又可抑制對細胞具有損害作用的蛋白如GSK-3和Bad，起到減輕細胞損傷的保護性作用;④組蛋白脫乙酰基酶5(HDAC5)為CaMKⅡ的底物，HDAC5抑制保護性轉錄因子 MEF的產生，CaMKⅡ通過抑制HDAC5，從而增強MEF表達，從而間接發揮對神經元的保護性作用。

5 結語

神經缺血損傷過程中，CaMKⅡ的作用較為復雜，一方面胞質中一定水平的CaMKⅡ活性是維持細胞生存的必要條件之一;另一方面，胞質CaMKⅡ異常激活又可觸發細胞死亡信號通路而加重細胞損傷，如何恰當調控細胞質CaMKⅡ的濃度及活性，既保持細胞生存所必需又不致引起異常激活的細胞損傷是未來該領域研究的重點。

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