儲糧微生物危害檢測技術研究進展

張燕燕 蔡靜平 蔣 澎

ZHANG Yan－yanCAI Jing－pingJIANG Peng

（河南工業大學生物工程學院，河南 鄭州 450001）

糧食儲藏過程中的品質易受到氣候、季節等自然因素和糧食品種、入庫水分等自身因素的影響。若要提高糧食的儲藏效果，保持糧食的食用品質，需要對糧食儲藏過程中的各種變化進行實時監測，保證儲糧安全。糧食中除了淀粉、脂肪、蛋白質等基本營養物質組成外，還含有各種維生素、微量元素等多種天然有機物質，是各種微生物生命活動中較為理想的天然營養基質，在合適的溫度和濕度條件下，它們的生長、繁殖會引起糧食的品質劣變。尤其是微生物中的霉菌，其生長繁殖能力強，可直接或間接的利用糧食中的各種營養物質，分泌多種水解酶（淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶）將糧食轉化為自身所需的小分子營養成分，進行代謝活動，使糧食的各種品質指標和加工工藝指標發生變化，嚴重影響糧食的價值，有些霉菌，例如黃曲霉菌（Aspergillusflavus）會產生劇毒的黃曲霉毒素進一步危害人畜健康［1］。因此，對儲糧過程中霉菌活動的監測是保障儲糧安全性的關鍵環節。

傳統的霉菌培養檢測方法雖然可以為儲糧的安全性提供一定的指示，但是其檢測操作技術專業性強、要求高、操作程序繁瑣、檢測工作量大、時間長，難以滿足儲糧經常性監測的需要。另外，糧食中的許多霉菌生長速率和營養要求的差異性大，使一些本來在儲糧環境中不能進行生長和代謝活動的霉菌孢子萌發和迅速生長，給帶菌量的檢測結果帶來干擾。例如，常見的根霉 （Rhizopus）和毛霉（Mucor）等霉菌在大多數糧食儲藏條件下是不能生長的，但在人為培養的適宜水分和溫度條件下卻會以遠超曲霉的速度生長。實際儲糧中初期的危害霉菌通常為灰綠曲霉（Aspergillus glaucus）和青霉（Penicillium），隨著水分的增高，黃曲霉和其他曲霉逐漸變為優勢曲霉［2］。但是在平板菌落培養技術中檢測到這種變化不明顯，使檢測結果不能準確反映儲糧環境中正常生長霉菌的類群，影響人們對糧情的判斷。此外，霉菌的生長周期需要7d左右，檢測結果不能與實際糧情變化同步，表現出滯后性［3］。

近年來，在食品行業應用較多的分子生物學微生物檢測技術也被用來檢測儲糧霉菌，如DNA探針技術、PCR技術、基因芯片技術等［4］，這些技術雖具有較高的靈敏度和檢測準確性，但操作程序復雜，對操作人員技術程度要求高、檢測費用昂貴，在儲糧監測中的應用受到限制。利用霉菌生物學特性對儲糧安全的監測已經有較多的研究和應用，可以滿足不同糧食和儲藏特點的需求。文章主要闡述利用微生物生物學特性監測儲糧安全的研究進展。

1 糧溫檢測技術

糧食儲藏過程中出現霉菌生長時，由霉菌呼吸釋放出的熱量將大大超過糧食自身呼吸所釋放的熱量，由于糧堆是熱的不良導體，造成熱量在糧堆中積累，使糧堆溫度升高，借助糧堆溫度檢測的方法可以快捷地發現儲糧的異常狀態［5］，這是糧溫檢測技術在儲糧中應用的基礎。從1998年起，中國對大型儲備糧庫開始進行重點建設，糧倉倉容、結構、設施以及管理手段都上了一個新臺階，糧溫檢測技術被進一步推廣和普及，成為儲備糧庫中標配的儲糧工藝之一［6］。

糧溫檢測技術由最初的溫度計檢測發展到電子傳感器檢測，并隨著電子傳感、計算機和網絡技術的不斷創新而快速發展。早期的測溫傳感器通過測量糧堆內部生命體代謝所釋放出的熱量，經過信號轉導系統最終將數字顯示在測溫表上。隨著電子技術的發展，由傳統的熱敏電阻、PN結溫度、熱電偶傳感器向集成化溫度傳感器方向發展［7］。集成化溫度傳感器是將熱敏原件、信號處理和校正等各種輔助電路集成在一起的半導體集成電路型溫度傳感器［8］，具有檢測靈敏度高、線性好、不需要任何溫度參考點等優點，不僅簡化了傳統的電路設計工序，還提高了測量精度，從而被迅速地普及和推廣。

在實倉儲藏中，考慮到成本等因素，中國大型糧倉主要使用的是數字化溫度傳感器［9］，可以實現自動巡回檢測，并開發出了無線檢測系統，簡化了復雜的布線工序，將無線測溫傳感器插入到糧堆的不同位置，可對糧堆中不同橫向距離和深度進行立體檢測，通過計算機平臺的控制可以準確定位到糧堆的不同位置采集數據，實現全方位、立體化監控，若有異常，可立即采取措施。雖然糧溫檢測是目前中國大型糧倉采用的主要糧情監測方法，但是隨著對儲糧安全要求的提高，該方法有些缺陷也逐漸顯現出來。首先，糧溫檢測仍具有滯后性，大量實倉儲藏研究［10］表明，測溫系統顯示溫度異常時，糧食往往已經發生霉變、變色、變味甚至出現結塊。其次，在糧食早期霉變過程中，霉菌釋放的熱量較少且糧堆表面所產生的熱量容易散失，會給測量結果造成干擾，不易做到糧食霉變早期的監測。所以，除了繼續研究和開發測溫傳感器以提高糧溫檢測靈敏度和準確度外，還應該利用儲糧霉菌代謝活動的其他特性研發儲糧安全監測的方法。

2 CO2氣體檢測技術

糧食呼吸和霉菌呼吸均能產生CO2氣體，如果溫度和水分達到適合霉菌生長的情況，那么霉菌的呼吸強度遠遠大于糧食自身的呼吸強度，霉菌呼吸作用釋放CO2氣體的量也遠大于糧食自身呼吸釋放CO2氣體的量［11］。依據霉菌呼吸產生CO2氣體這一生理特性，已研發出多種CO2氣體傳感器。一般的檢測原理是利用微型真空泵采集糧堆氣體，通過流量計的控制將氣體輸送到CO2氣體傳感器進行測量，數值最終在顯示屏幕中讀取，依據CO2氣體含量的變化監測儲糧霉菌的活動狀態，以及時采取措施保證糧食安全。CO2氣體檢測技術用于監測儲糧安全的實驗室研究已經較為深入。梁微等［12］進行了不同水分含量小麥模擬儲藏中CO2氣體含量變化與小麥帶菌量相關性的研究，證明隨著小麥水分含量的增加，檢測的CO2氣體含量隨著小麥儲藏天數的增加逐漸上升，超過安全水分的小麥檢測到的CO2氣體濃度與帶菌量變化的相關性系數達到0.95以上，說明CO2氣體檢測法可以用來指示儲糧中微生物的活動狀態。耿旭等［13］研究了不同霉菌活動生理狀態下CO2氣體濃度的變化規律，霉菌從孢子萌發、菌絲生長到子代分生孢子形成的階段CO2氣體濃度隨時間的變化呈“S”型曲線；霉菌在代謝旺盛期即菌絲生長階段由于代謝速度加快，釋放出的CO2含量增多，是霉菌開始大量生長的信號。由此可見，CO2氣體檢測技術的靈敏度更高，可比帶菌量檢測更早、更精確地反映儲糧微生物危害情況，與糧溫檢測相比，CO2氣體檢測可以提高糧食早期霉變監測的準確率。

對實倉糧食儲藏安全的CO2氣體監測技術目前尚處于試驗階段，程樹峰等［14，15］利用便攜式CO2氣體檢測儀對實倉儲藏小麥、稻谷的表面進行霉菌生長的檢測，結果表明，實倉中安全水分以下的小麥或稻谷檢測到的CO2氣體濃度未見明顯異常，而臨界水分或偏高水分條件下可以明顯檢測到CO2氣體濃度的升高，糧食開始霉變，實倉中易受潮濕的部位CO2氣體的濃度明顯上升。Maier等［11］利用CO2氣體傳感器對實倉中的糧食進行數年的安全檢測研究，分別在糧倉頂端、倉壁、通風口等處設置CO2氣體傳感器，通過對CO2氣體濃度的檢測證明了實倉中CO2氣體檢測法要比電子測溫法更靈敏、更準確的判定糧食霉變的程度和位置，根據CO2氣體傳感器的讀數總結出糧食發霉程度的規律，CO2氣體體積分數占環境氣體的0.04%～0.05%以內均可視為安全儲藏。王智等［16］通過對模擬糧倉預設霉變點探索了稻谷儲藏期間CO2氣體擴散規律的研究，CO2氣體向水平方向擴散具有沉降性，在糧堆中下層設置氣體檢測點檢測CO2氣體濃度更能準確反應出實時糧情，通過對CO2氣體擴散規律的研究進一步提高了儲糧霉菌早期活動的檢測效率。

在實倉儲糧中應用CO2氣體檢測技術具有快速、靈敏、準確、成本低等檢測特點，但是，由于糧食儲藏的倉型不同，糧食自身品質差異較大，儲藏過程中還有昆蟲等產生CO2氣體生物的影響，加上不同環境溫濕度將影響CO2氣體的擴散特性，因此，不能只依靠CO2氣體檢測數據的變化簡單定義糧食的發霉情況，需結合其他快速檢測手段進行綜合判斷。在敞口儲藏的糧堆CO2氣體檢測中，還需考慮CO2氣體釋放對檢測結果的影響。

3 電子鼻檢測技術

電子鼻檢測技術于1982年由Warwick大學的Persand和Dodd提出［17］，是一類通過模仿哺乳動物嗅覺來對環境中氣味進行鑒別的裝置，現主要應用領域是食品衛生行業，并向食品生產的在線監測研究方向發展［18］。其在糧食領域中的應用目前仍處于實驗室的探索階段。在糧食倉儲行業，電子鼻的研究方向主要針對糧食新陳度的檢驗、儲糧害蟲以及儲糧霉菌的檢測。

如何在糧食開始霉變初期及時預測是將電子鼻技術引進糧食儲藏行業中的主要目的。N.Magan等［19］研究發現霉菌利用糧食有機物生長繁殖的過程會生成許多中間代謝產物，且隨著儲藏時間的不同，發霉糧食所散發的揮發性物質濃度呈明顯升高趨勢。Linton等［20］對儲藏的小麥、玉米、高粱中揮發物進行氣質色譜聯用的分析表明，揮發物由醇類、醛類、酮類、酯類等組成，微量時不易被人們察覺，當積累到一定量散發出刺鼻的氣味時，糧食幾乎喪失了儲藏價值，而電子鼻可以利用自身的氣敏傳感器陣列、信號預處理單元和模式識別系統靈敏地分析氣體成分，可以在產生氣體初期及時預警，避免上述情況的發生。N.Magan等［21］通過對常見儲糧霉菌中間代謝揮發物的測定也印證了上述結論。

自1997年Jonsson等［22］通過參考電子鼻在白酒、香水、煙草等方面的應用提出電子鼻也可以應用到谷物安全檢測之后，圍繞儲糧霉菌早期檢測的研究取得了一些研究進展，主要涉及電子鼻裝置的更新及應用。在裝置研發方面，主要提升氣敏傳感器的靈敏度，采用的方法是相對法、差分法、對數法和歸一法［23］，為了進一步提高準確性，采用統計模式識別技術、人工神經網絡技術和進化神經網絡技術對輸入的信號進行進一步處理［24］。鄒小波等［25］使用8只傳感器陣列組合對響應陣列進行徑向基函數（RBF）神經網絡分析，對霉變糧食的判定率達到90%以上。潘天虹等［26］利用厚膜金屬氧化錫氣體傳感器陣列結合RBF神經網絡系統對傳感器模式識別處理系統進行優化，提高了電子鼻系統判定谷物霉變的準確率。偉力國等［27］研制的電子鼻能夠快速對小麥霉變進行識別，該電子鼻檢測系統由5只同系列不同型號的氣敏傳感器組成，每個傳感器提取4個特征值，采用RBF神經網絡進行模式識別處理，正確識別率達到93.3%，證明對小麥霉變的檢測是可行的、有效的。進一步的研究還對電子鼻裝置的設計進行了穩定性的優化，包括6點平滑法去除傳感器的噪聲［28］、隨機共振法處理試驗數據克服傳感器基線漂移以及不同傳感器陣列的組合優化等［29］，此外電子鼻儀器的設計也向便攜式發展［30］。國外在儲糧霉菌檢測應用方面起步較早，Jonsson等［22］曾應用研制的電子鼻裝置判別糧食是否發霉以及霉變程度，Roberto Paolesse［31］應用電子鼻對儲藏中不同谷類表面環境進行氣體成分分析，并通過GC－MC進行可靠性分析，成功地判定了發生霉變的谷類。N.Magan等［19］對電子鼻的分析表明，根據某類霉菌特殊的代謝物質可以判定糧食受到何種霉菌的污染。在中國，對電子鼻的應用性研究已經可以在糧食霉變初期做到成功預警。近年來，主要利用商品化電子鼻結合自行研制設備進行檢測條件的優化和應用性試驗，宋偉等［32］應用德國PEN3便攜式電子鼻檢測儲藏中粳稻的氣體環境，應用偏最小二乘（PLS）分析法提升了預測粳稻中霉菌數量的可行性。惠國華等［33］自行研制的電子鼻可以追蹤儲糧霉變的過程。周顯青等［34］對電子鼻傳感器陣列進行優化，并對40種玉米樣品進行霉菌檢測，應用不同算法（Euclid、Malahanobis、Kohonen和DFA）分析后證明，Kohonen和DFA算法對玉米霉變程度的判斷準確率可大幅提升。以上研究結果證明，電子鼻檢測技術是依據微生物代謝特性快速檢測儲糧安全的方法，可在儲糧早期霉變檢測中發揮重要作用。

4 微生物酶活性檢測技術

微生物酶活性檢測是根據霉菌在進行新陳代謝的同時，會不斷向外界分泌胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶、過氧化氫酶等，利用菌體產酶的代謝特性間接檢測糧食帶菌量的方法。郭雷等［35］對儲糧主要危害性霉菌過氧化氫酶特性進行了研究，證明了不同種類儲糧霉菌可以分泌過氧化氫酶，且過氧化氫酶的酶活性與菌體數量具有顯著的線性相關性，酶活性越大，菌體數量越多。筆者［36］曾以對基于霉菌分泌過氧化氫酶的特性與糧食帶菌量變化建立的聯系為依據提出了糧食微生物活性的概念，并對建立的微生物活性檢測法進行可靠性研究，使微生物活性檢測在早期預防糧食霉變中可以獲得較準確的信息。試驗結果表明，在不同培養基培養霉菌菌體數量不變的條件下，檢測的活性值卻有較大的差異，但與霉菌生長的跡象一致，因此，在霉菌還未出現明顯生長的情況下，可以快速、準確地發現儲糧的異常狀態。在后續研究［37］中，對不同水分、不同種類的糧食進行微生物活性與糧食品質相關性的研究表明，糧食微生物活性值與糧食品質變化有顯著的相關性，進一步證明了該方法用于檢測糧食微生物的準確性。魏鑫等［38］利用微生物活性檢測技術對不同品種小麥霉菌活動的差異進行了研究，該方法與傳統的平板菌落計數法的分析結果高度一致，并且采用微生物活性檢測技術比傳統檢測方法更為靈敏、可靠。胡元森等［39］利用霉菌有氧呼吸過程中脫氫酶的特性，建立了適用于糧食中幾種代表性霉菌脫氫酶活性的測定方法，用該方法測定小麥儲藏過程中微生物活性值與霉菌數量也發現有較好的相關性。

微生物酶活性檢測技術在實倉儲糧安全監測中也有一些試驗性的應用。田海娟等［40］利用微生物活性檢測技術對稻谷儲藏期間微生物的活動規律進行了研究，在高相對濕度環境下，糧堆表層的微生物活性值變化明顯，且糧層有阻擋濕度擴散的作用，糧堆下層微生物活性值變化不明顯。在超過1 000t的大型儲藏玉米倉中，利用微生物活性檢測技術監測倉內高水分玉米在系統升溫及通風降水過程中微生物活動的狀況，根據微生物活性值制定通風、加熱等參數，達到了早期防霉儲藏的目的［41］。微生物酶活性檢測法與傳統霉菌檢測方法相比，具有耗時少、靈敏度高、檢測結果更加準確的特點，其顯示結果反應糧食表面活菌的數量，更加貼切糧食防霉儲藏的本質。微生物活性檢測技術可以提高儲糧霉菌早期預防的效率，最大限度維護糧食品質，提高儲糧的安全性。

5 展望

儲糧安全與糧食微生物的存在狀態密切相關，休眠或非生長狀態的微生物對儲糧安全沒有影響，糧食安全的威脅來自于活動著的微生物，其主要危害類群是霉菌。立足于對霉菌生長和代謝特性相關的生物學特性進行檢測，借鑒食品微生物的某些成熟的方法［42］，可以滿足對儲糧安全性的有效監測。現有的相關方法應該根據糧食的儲藏特性和具體需求，進一步對檢測方法進行適應性研究，對儀器、設備及檢測過程進行優化；同時也可通過對微生物的多種生物學特性進行綜合分析，彌補單因素檢測的不足，更加準確、有效地反映儲糧安全性的真實狀態，提高儲糧安全早期預防的效果，為減少儲糧損失提供技術基礎。

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