參芎注射液對腦缺血再灌注損傷小鼠記憶損傷的保護作用

河南省上蔡縣人民醫院（463800）李國選

參芎葡萄糖注射液是丹參素、川芎嗪復合制劑，丹參素、川芎嗪為傳統的活血化淤中藥提取物[1][2]。既往研究表明參芎注射液可有效改善腦梗死大鼠血液粘滯狀態、抑制炎癥反應、抑制血小板聚集、減少氧自由基的產生、下調Caspase-3等表達、上調BCL-2表達，從而發揮抑制細胞凋亡和抗炎的作用[3][4]。

近年來的研究發現，腦缺血事件的發生往往伴有神經行為學與學習記憶能力的異常，而神經遞質興奮性氨基酸和及其相應受體與學習記憶的關系非常密切，但參芎注射液改善缺血誘導的學習記憶損傷作用是否與其腦內神經遞質有關，目前還未見報道。本研究試圖用重復腦缺血再灌注建立學習記憶損傷的小鼠模型，從神經遞質方面探究參芎注射液對缺血誘導小鼠記憶損傷的保護作用，為闡明參芎注射液抗腦缺血的腦內機制提供進一步的實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物 實驗用ICR雄性小鼠，90只，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[中國上海，合格證號SCXK（滬）2008-0016]，購入時體重18～22g，8只/籠飼養，12/12小時光/暗周期調節，室溫23±1℃恒溫，濕度50～60%，自由進食進水。動物購進后，進行適應性飼養后，方可開始實驗，實驗時同批體重范圍不超過2g。

1.2 實驗試劑與藥物 2%戊巴比妥鈉；參芎葡萄糖注射液（佰塞通）：上海景峰制藥有限公司，每100ml含丹參素20mg、川芎嗪100mg。

1.3 主要儀器設備 小鼠跳臺儀，Morri水迷宮（中國醫學科學院藥物研究所）；被動回避反應箱；LC-6A高效液相色譜儀和RF-530熒光檢測儀（日本島津）；TG328A型電子分析天平GL-20A型高速冷凍離心機（湘儀總廠離心機廠）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥 健康雄性小鼠隨機分5組：假手術組（12只）、缺血模型組（11只）、參芎注射液高劑量組（12只，80mg/kg）、參芎注射液中劑量組（13只，40mg/kg）、參芎注射液低劑量組（12只，20mg/kg）。參芎注射液治療組分別腹腔注射不同劑量的參芎注射液，連續給藥7d。模型組和假手術組在相同時間點注射等量生理鹽水。第7d給藥后30min 做缺血再灌注手術，術后第2～7d進行行為學檢測，期間繼續給藥。

2.2 動物模型的制備 2%戊巴比妥鈉腹腔注射（40mg/kg）麻醉后，將小鼠仰臥固定，切開頸部皮膚，分離兩側頸總動脈，用無創動脈夾阻斷兩側血流造成前腦缺血，8min后松開動脈夾恢復血流即為再灌注，10min后再次阻斷血流，缺血8min后松開動脈夾，實行再灌注，并縫合頸部皮膚。出現心跳加快，呼吸幅度加深，頻率先加快、后減慢典型生理變化過程的小鼠，作為缺血成功樣本入選。對照組行假手術，即分離兩側頸總動脈但不阻斷血流。

2.3 自發活動觀察 術后第2d進行。實驗時，環境保持絕對安靜，室溫20～24℃，濕度50～70%，光照度800～1200LUX，抓拿動物及給藥時，動作輕柔，盡量減少外部刺激給動物帶來的精神狀況和情緒的不良反應，并將小鼠預先在環境中適應30min，將其放入自發活動箱中活動1h，觀察記錄運動軌跡，用計算機系統進行分析。

2.4 跳臺試驗的觀察 術后第2～3d進行。測試裝置為被動回避反應箱，先讓小鼠在反應箱內銅柵上（未通電）適應環境3min，然后給銅柵充電，動物由臺上跳下后，受到電刺激后產生痛覺，會立即跳回平臺以回避電擊，如此連續訓練10min，記錄訓練過程中錯誤次數（動物下臺受到電擊的次數）及10min內受到電擊的總時間，作為學習成績。24h后，將動物再次置于臺上，以同樣方式考察記憶保持。記錄動物第一次跳下平臺的潛伏期及10min內的錯誤次數和受到電擊的總時間，作為記憶結果。

2.5 空間學習記憶的測試 空間學習記憶的訓練與測試參照Morris水迷宮法[5]，術后第4d進行。水迷宮是一個直徑為90cm，高為45cm的黑色圓形水池，池內水深25cm，水溫（27±1）℃，一個8cm×8cm 透明玻璃制成的逃避平臺固定在水面下1cm處。訓練時把小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠找到平臺的時間，即潛伏期。小鼠在平臺上停留30s后，放回飼養籠內休息30min，然后進行下一次訓練，每次在不同象限將小鼠面向池壁放入水中。如果小鼠在90s內找不到平臺，就人為把小鼠放到平臺上停留30s，這時找到平臺的時間記錄為90s。每天連續訓練4次，并取4次的平均值作為當天的成績。以上訓練為期3d，作為學習成績。

訓練時小鼠找到逃避平臺所用時間越少，表明其學習記憶能力越強。術后第7d進行測試，作為記憶能力的測試。

2.6 腦組織谷氨酸含量檢測 實驗第8d將實驗小鼠迅速斷頭，快速取出腦皮質、雙側海馬（置于冰塊上），新鮮腦組織洗凈血液，擦干，稱質量后倒入Ependof管中加入0.1mol/L鹽酸（HCl）在冰浴下超聲粉碎細胞，制成勻漿，12000r/min離心10min。勻漿后離心取上清液200μL，加入衍生劑DNFB，于70℃恒溫水浴中衍生20min，加磷酸鹽緩沖液至1ml，高速離心15000r/min，10min，取上清液進樣。色譜條件：流動相為醋酸鈉緩沖液，乙腈；流速為1ml/min；波長為360nm；柱溫為35℃；滿標吸光度（AUFS）：0.01。

總之，參芎注射液能減輕缺血再灌注引起的腦損傷，改善小鼠學習記憶能力，該作用可能與其提高腦組織谷氨酸含量有關。