ELISA法檢測的影響因素及其對策

譚立明

(南昌大學第二附屬醫院檢驗科,江西 南昌330006)

酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是一種特殊的試劑分析方法，在免疫酶技術的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術，其試劑易于保存、結果判斷較為客觀，是目前實驗室檢測抗原抗體最經濟、最普遍的試驗診斷方法。其原理是將抗原(抗體)結合到固相載體表面，再將待測抗體(抗原)、酶標抗原(抗體)與固相抗原(抗體)結合形成免疫復合物，經洗滌使免疫復合物與待測抗體(抗原)呈比例，加入酶反應底物使其與固相上的酶反應變色，根據顏色做定性或定量分析，得出檢測結果[1-3]。ELISA法步驟包括標本的采集、保存、加樣、溫育、洗板、顯色、比色以及結果判斷[4]，臨床采集待檢樣本過程中常出現溶血、黃疸、脂濁，類風濕因子、高濃度非特異性免疫球蛋白、藥物及血液抗凝劑等亦對結果產生一定影響[5]。雖然操作簡單，但還是需要注意一些因素的影響[6-8]，試劑的選擇、正確的操作、優良的儀器都與檢測結果密切相關。本文根據樣本的影響因素及操作流程中可能出現的相關問題展開筆述，對ELISA法檢測的影響因素及相應對策作一綜述，希望提高ELISA法檢測的準確性。

1 樣本的影響因素

臨床采取空腹抽取靜脈血清作為ELISA檢測標本，標本采集過程中很多因素可能導致檢測結果不準確，如溶血、脂濁、類風濕因子、甲胎蛋白、高濃度非特異性免疫球蛋白、藥物、血液抗凝劑及細菌污染等。

1.1 溶血 溶血時紅細胞破裂釋放出具有過氧化物酶活性的物質干擾試驗結果出現假陽性，孫輝等[9-11]通過實驗報道樣品溶血血紅蛋白濃度不大于4.95g/L，對雙抗原夾心法、間接法、競爭法、捕獲法檢測結果均無影響。徐傳國[12]認為溶血易導致弱陽性標本漏檢，黎學東等[13，14]認為雖然溶血會對HB-sAg檢測造成假陽性影響，但是小于8g/L時可以檢測；王紅等[15，16]使用不同的干擾物濃度及分析方法得出結論，隨著溶血程度的增高HBsAg檢測OD值有輕微增高趨勢；但是溶血檢測抗-HIV無影響[17]。

臨床工作中無法采集到無干擾物血清或因操作因素導致標本出現溶血時，評估標本干擾物含量及標本處理情況，在有效范圍內進行ELISA檢測，對于溶血標本可先測定血漿Hb含量，不大于5g/L時可用于HBsAg的檢測，超過此范圍的陽性標本最好做復檢，避免假陽性結果發生[18]。目前也有通過增設試驗孔的方法來處理輕度甚至重度溶血標本的檢測，使溶血造成的假陽性結果得到糾正，且有非常顯著性統計學意義。

1.2 脂濁 孫輝等[9]通過實驗報道乳糜樣品含福爾馬肼濁度小于1460FTU的乳糜時，對雙抗原夾心法、間接法、競爭法、捕獲法的檢測結果均無影響。汪建國等[16]認為脂質顆粒會黏附在反應孔內壁，使吸光度A值增高出現假陽性；徐學新等[19，20]認為不同程度的乳糜血液隨著放置時間的延長OD值下降，導致不同程度的漏檢。雖然可采取高速離心的方法可將乳糜微粒去除，此過程可能對檢測結果帶來影響，然而盲目采取高速離心等方法試圖去除干擾物并不可取。

1.3 黃疸 結合膽紅素濃度不大于344μmol/L對雙抗原夾心法、間接法、競爭法、捕獲法的檢測結果均無影響，超過濃度的樣本應重新采集，對于黃疸病人為保證檢測結果的可靠性可選擇其他檢測方法。

1.4 類風濕因子 在類風濕患者及健康者血清中常含有類風濕因子 (RF)，RF為一種抗人或動物變性免疫球蛋白IgG的自身抗體，與IgG分子Fc片段抗原決定簇結合，常見的有IgM、IgA、IgG、IgE型，均能與變性IgG抗體產生非特異性結合，在ELISA檢測抗原的試劑盒中，RF可與固相包被的表面抗體的Fc片段及酶標記物中免疫球蛋白結合。研究[20]表明高濃度的類風濕因子可引起ELISA檢測抗原檢測出現假陽性結果，類風濕因子可與固相上包被的特異性抗體IgG及隨后加入的酶標特異性抗體IgG結合出現假陽性結果[21]。穆海霞等[22，23]研究報道高濃度 RF(＞500IU/ml)對 ELISA 檢測HBsAg產生假陽性結果較明顯，且與RF濃度無顯著相關性。

在臨床工作中，若出現乙肝兩對半少見模式，如僅HBsAg陽性，應結合患者病史并采用其他方法如微粒子酶免疫法進行復檢，慎重報告。

1.5 抗體、補體 人類血清中含有天然異嗜性抗體，而異嗜性抗體可通過交聯固相和酶標的單抗或多抗產生假陽性結果。來自哺乳動物的固相抗體及酶標二抗可激活人體補體系統，在反應過程中抗體分子結構發生變化，暴露補體的結合位點，產生假陽性結果，也可能固相抗體因為活化補體的結合導致抗原抗體的表位結合能力下降，出現假陰性結果。研究報道[23]高濃度的乙型肝炎表面抗體會引起HBsAg檢測出現假陰性結果，臨床需注意避免攜帶污染造成檢測結果錯誤。

1.6 血液保存液 志愿者獻血一直是各醫院血站血液的主要來源方式，低濃度標本的檢測對輸血安全至關重要，按照《獻血者健康體檢要求》和《血站實驗室質量管理規范》，獻血者需檢測抗-HIV、抗-HCV、HBsAg、梅毒抗體等，且必須建立初次有反應標本的復檢程序，常采用抗凝試管血和采血導管血同時復檢，然而不規范的操作常導致試管標本和末端血袋管混入血液保存液。血液保存液成分、pH值、離子強度等影響均可能導致檢測結果錯誤。血液保存液對ELISA法檢測抗-HIV結果影響明顯，能明顯減低試劑對抗-HIV的檢測能力，造成假陰性結果；也有研究報道[24]，血液保存液對HBsAg、梅毒抗體、ALT弱陽性試管標本及血袋管標本檢測結果影響有統計學意義，造成弱陽性結果漏檢，但對抗-HIV陽性結果檢測無影響；張桂芳等[25]通過實驗證明抗凝劑對HIV陰性抗體檢測結果無影響，但是當抗凝劑高于5mg/ml時對HIV陽性測定造成明顯負干擾，同時也影響血細胞分析，且同一抗凝劑同一濃度對不同公司的試劑檢測HIV抗體影響也不相同。

血液保存液是必須使用的，可以通過以下方法避免血液保存液帶來的不良后果：完善標本留樣確認程序，確保標本與血袋同源，采用試管標本代替血袋標本，避免從血袋導管采取復檢標本；采用新型留樣血袋，附帶留樣試管，將最初采集時未混入血液保存液的血液用于檢測；規范血液留樣操作，防止待檢標本混入血液保存液，若混入，可將抗-HIV的臨界值相應調低。如果使用EDTA-K2做抗凝劑，最好將濃度控制在1.5~2.5mg/ml的范圍內，對于較難采集到足夠血液樣品的患者可采用血細胞分析檢測HIV抗體。如采用抗凝血將做檢測樣本時最好與血清樣本進行對比試驗，并建議廠家對試劑的干擾能力進行嚴格的質量控制，說明適合使用的試劑及其相應濃度。

1.7 藥物 研究表明，高效價乙型肝炎免疫球蛋白可以和HBsAg形成免疫復合物，使HBsAg陽性患者檢測呈陰性，出現兩對半少見模式；部分HBsAg陰性者接種乙肝疫苗1~2周后血清中可檢測到HBsAg，造成HBsAg一過性陽性，所以乙肝疫苗接種后一個月內最好避免做乙肝兩對半檢查。

1.8 細菌 一些細菌的菌體中可能含有內源性過氧化物酶會對使用相應酶做標記的測定方法產生影響，污染細菌可能含有內源性辣根過氧化物酶，使試劑出現非特異性顯色造成假陽性而干擾結果。

1.9 樣品因素小結 綜合得出，在正確的時間采集標本并防止污染、避免破壞，在干擾物處于一定濃度范圍內(膽紅素濃度≤344μmol/L，溶血血紅蛋白濃度≤4.95g/L，乳糜樣≤1460FTU)進行 ELISA四種方法檢測均不影響檢測結果，但對競爭法檢測HBeAb的影響有統計學意義。對于貧血性溶血、新生兒溶血性黃疸及抽血不當等造成的溶血標本盡量避免二次抽血對病人造成不必要的傷害。

2 操作的影響因素

2.1 試劑的準備 試劑的質量如抗原抗體的純度及親和力、標記物的比活性、滴度及特異性等直接影響檢測結果，為保證檢測質量，所有試劑必需經國家食品藥品監督管理總局注冊批準、批檢測合格，臨床評估特異性、敏感性、穩定性較高且在有效期內才有使用價值。不同廠家試劑敏感性、特異性不盡相同，有報道不同廠家酶標板孔間A值差大小可達15%，標記酶的活性及顯色液的穩定性也相差較大，所以合理有效的試劑選擇尤為重要[26]，對ELISA試劑盒應正確選擇，定期評價并建立科學的接收標準，結合常規血液篩查情況，對實際的均一性、適用性、穩定性，選出靈敏度、特異度及精密性合適的試劑保證檢測結果的準確。有報道[27，28]不同廠家-IgG配制成的抗HCV-cAg酶結合物溶液對檢測結果有區別，配制抗HCV-cAg酶結合物溶液前應檢測小鼠-IgG與產品的適配性。其次試劑盒的儲存方式、運輸條件及有效期均為影響檢測結果的重要因素，試劑盒一般2~8℃冰箱保存，注意不要緊貼冰箱儲存室后壁以防止試劑凍結失效，可避免使用時試劑受溫差影響導致酶標板上凝集小水珠及反應出現溫差而影響抗原抗體的反應。使用前需將試劑盒放置37℃恒溫箱溫育30min，且不同廠家、不同批號的試劑不能混合使用。剩余試劑應及時放入干燥劑密封保存在2~8℃冰箱，試劑打開后一周內有效，同時注意做好室內質檢，確保實驗結果的可靠性。

不同方法學的檢驗試劑會使乙肝兩對半結果出現不同，如臨床操作中電化學檢測HBsAg呈陽性，而采用ELISA檢測則呈陰性，此外，使用單抗或多抗試劑對檢測結果同樣造成一定的影響。研究表明ELISA檢測細胞因子時需要根據檢測的細胞因子選擇不同的裂解液進行處理，避免裂解液對細胞因子產生影響導致假陰性結果[29，30]。

2.2 樣本的采集、保存及預處理 標本的運輸及保存、檢測人員的自身素質均可能對檢測結果造成不良影響，為避免出現錯誤樣品應準確標明編號、種類、受檢者姓名及采集時間，收集后認真核對，拒收不符合要求的標本及申請單，嚴格按照拒收制度處理，同時處理合格標本，做好后續工作，避免延誤導致標本出現溶血等其它不良情況。標本的預處理對檢測結果有非常明顯的影響，臨床工作中有時為了快速得出檢測結果在血液開始凝固前強行離心分離血清，血清中殘留的纖維蛋白絲對實驗結果造成影響[31]，標本離心需徹底且必須待血液凝固后方能分離血清，也可在標本采集時使用帶分離膠的采血管提取[32]，使用未混入保存液的血液做檢測標本。在此過程中保證待檢標本新鮮、避免細菌污染，否則易出現假陽性結果，若不能及時檢測可將分離的血清于4℃保存，超過一周于-20℃保存，避免反復凍融，防止出現假陰性結果[33]。若血清中含有類風濕因子或免疫復合物也將造成假陽性結果。

2.3 加樣 ELISA檢測加樣時應垂直將樣本準確加入微孔底部，注意避免吸頭碰到酶標板上的包被物，盡量慢吸快放，防止濺出或產生氣泡，避免液體外濺使血清殘留在反應壁上。每次吸樣注意更換吸頭，做到一樣一吸頭，避免交叉污染，干吸頭每次加樣前在血清中抽吸三次保證吸樣準確，滴加試劑時建議先將滴瓶搖勻擠去第一滴再加樣。加樣前先將微孔板平放在板架臺上，以免對洗板機的自動操作帶來影響，為了保證加樣的準確性，建議使用準確性高的微量移液器且定期進行校正。加樣品稀釋液、酶結合物應用液、底物應用液及終止液時可采用定量多道加液器，迅速完成加液過程，加樣后用不干膠或膠帶紙封好酶標板防止水分蒸發或雜物進入孔內，注意封板膜不可二次利用，避免交叉污染，剩余的微孔板、不干膠或膠帶紙與干燥劑一同保存在備用自封塑料袋中。大批量檢測大型機構體檢標本時可采用直接加入適量血清的加樣模式，經濟環保提高工作效率[34]。

在實際操作過程中，待檢標本和酶標志物先后順序加入，于是在競爭法中因為兩者的不同時加入而存在一個“不公平”競爭現象，研究表明，競爭法ELISA檢測受加樣方法的影響存在統計學意義[35]，將標本和酶標志物先在試管中等量混和均勻后再加入酶標板小孔杯中可降低抗-HBc檢測的假陽性率。

2.4 溫育 溫育是ELISA至關重要的一步，不同的溫育環境對檢測結果有影響，操作中應嚴格按照說明書控制溫育時間及溫度，并注意封閉避免邊緣效應。為確保各板溫度都能迅速達到平衡，不可將反應板疊加放置，設定的溫度及時間嚴格按照說明書進行，一般加入待測標本后使其與固相抗原(抗體)置于37℃環境下溫育。因為很多恒溫箱的構造，溫度及檢測的溫度并非酶標板溫育溫度，所以使用恒溫箱溫育時建議將溫度計置于酶標板旁，保證酶標板旁溫度為37℃。干育和水溫的影響差異較為明顯，建議使用水溫，注意將固相板放入水中，防止受熱不均勻。

溫育時間是影響檢測結果的一大因素，實際操作過程中工作人員常常試圖縮短溫育時間提高工作效率，曹青梅等[36]通過實驗證明，對于低濃度的標本，待測標本與固相抗體反應時間過短，極易引起漏檢，反應時間最少30min以上。羅保紅等[37]報道，酶標反應預孵時間在溫室中不超過15min，不但能保障ELISA檢測抗-HIV、抗-HCV的實驗結果，還能提高試劑檢測的靈敏度。其傳統溫育采用水溫箱易受污染，現多采用電熱、電子恒溫培養箱溫育，研究[38]表明溫育方式對ELISA檢測物影響。陳懷霞[39]報道，ELISA檢測中，溫度對抗原、抗體及酶反應的影響很大，溫度增高，分子運動加速，并可能出現非特異性反應，出現假陰性或者假陽性結果，檢測控制恒溫37℃可保證檢測的準確性。

2.5 洗板 洗板目的在于將特異性結合于固相上的抗原(抗體)與溫育過程中吸附的非特異性成份分離，使免疫復合物與待測抗體(抗原)呈一定比例，洗板是否合格直接影響檢測結果的準確性。洗板應嚴格按照說明控制洗板時間及洗板次數，ELISA檢測一般用洗滌液洗板3次，洗滌液應嚴格按照操作說明進行稀釋，洗液應注滿每個微孔并注意洗液不外溢，垂直甩板避免交叉污染，防止出現假陰性及假陽性結果。使用洗板機洗板可一定程度上避免環境污染、提高工作效率，洗滌開始時注意觀察每根吸液針是否一直插入孔底并吸干孔內全部液體，嚴格按照要求設置一定的洗板時間及洗板次數。洗板過程中注意沖力大小，避免沖力過大導致酶結合物丟失，吸光度值偏低。洗液應根據不同廠家的酶標板調整注水量，注意不要溢出孔外；稀釋洗液所用的蒸餾水或去離子水酸堿度適中，使配出的洗液pH在7.2~7.6范圍內，用非金屬容器保存，保持液體新鮮無污染、沉淀。洗板結束后將板拍干，應垂直扣在備好的干凈的吸水紙或毛巾上，且注意每次更新干凈的吸水紙或毛巾。

洗板時還應注意以下問題：(1)需每天校正注液量及殘液量，洗滌后殘液量不得大于2μl；(2)及時更換破損吸液針，避免破壞底板包被；(3)針對不同廠家酶標板注意調整吸液頭下降高度，避免沖洗針頭卡住酶標板；(4)注意調整洗液量，洗液量過多將溢出，過少將達不到洗滌效果；(5)關機前使用蒸餾水沖洗管道，避免洗液的結晶物堵塞管道；(6)不同種試劑盒的洗液嚴禁混合使用。

臨床操作中，工作人員由于擔心洗板次數過少達不到去除非特異性物質的理想效果而增加洗板次數，最近研究發現[5]，隨著洗板次數的增加樣本檢測的OD值降低，造成假陰性結果及灰區標本的漏檢。

2.6 顯色及結果判斷 試劑顯色時A、B液按順序加入且間隔不超過10min，如先將兩液混合再加樣則需保證等體積混合。顯色劑不宜過多，注意避光反應。顯色是最后一步溫育反應，酶將無色底物催化反應呈有色，反應的溫度和時間均為影響結果的重要因素，目前市場上大多數進口的ELISA檢測顯色溫度處于18~30℃。一定時間內，陰性孔可保持無色，但陽性孔會隨時間的延長而顯色加強。研究[40]表明，顯色溫度對實驗結果有明顯影響，顯色溫度不同，試劑最低檢測能力差距非常大，溫度低于21℃時試劑盒對于質控物的檢出能力下降，溫度過低導致結合反應速率變慢[41]，顯色不充分，造成低值陽性結果的漏檢，所以操作中應嚴格控制溫度。顯色時間不宜過短，因為一些低滴度可能不能及時出現反應，造成假陰性結果。結果判斷應按照說明書在規定時間內完成，研究報道[42]終止反應后的時間對OD值結果有明顯影響，10~15min陽性結果OD值逐漸下降，陰性結果的OD值有所上升，所以必須嚴格按照操作說明進行，薛春楊等認為結果判斷需在加入終止液后10min內完成，避免出現孔內結晶影響酶標儀的測試，避免強光下進行。

在加液和混合過程中產生氣泡、微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規則的表面都可能引起吸光值的升高，易造成假陽性結果，若顯色但酶標儀讀值為陰性的灰色值樣區的樣本不管其是否來源于高危人群均需復檢并參考參比試劑。

2.7 其它因素 實驗室的環境亦是影響試驗結果的一大因素，合理控制實驗室的通風、采光及防塵，實驗室的溫度及濕度可使用空調加以控制，濕度控制在35%~65%間，并避免噪音及電磁波干擾。

檢測結果對受檢者的家庭、生活及工作非常重要，可能帶來嚴重的精神痛苦及巨大的心理壓力，因此檢驗工作者應不斷提高自身素質，加強使命感與責任心，盡職盡責認真對待每一份待檢標本，嚴格按照實驗室的標準化操作，試劑的選擇和準備、樣品的采集和儲存、操作等方面，嚴格按照說明書要求，規范化操作，同時做好實驗室內質控[44，45]、室間質評，排除影響因素，嚴格控制試驗環境，牢牢把關試劑選擇、試驗溫度、儀器設備等每一環節，最大限度地降低檢測的系統誤差，加強自身理論知識的學習，在工作中總結經驗、揚長避短，減少人為因素對試驗結果造成影響，提高檢測的準確性，減少假陰性、假陽性結果的出現。

3 小結

ELISA檢測廣泛應用于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋以及結核等傳染類疾病的診斷，對于含有疑似干擾物的待檢樣本做相應分析，在保證結果可靠的前提下盡量避免二次抽血。為保證檢驗工作者的自身安全，操作時必須帶好口罩、手套，穿好工作衣，嚴格進行規范操作，防止交叉感染。有條件的情況下可使用酶聯免疫反應加速儀縮短反應時間，提高工作效率[46]。

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