蛋白C的檢測方法及研究進(jìn)展

陸松松，吳迪綜述，賈玫審校

(北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100044)

蛋白C是體內(nèi)重要的抗凝血因子，其在體內(nèi)的水平與年齡相關(guān)，多種因素可導(dǎo)致蛋白C缺乏。蛋白C缺乏癥人群發(fā)病率為0.2%~0.5%，在血栓病患者中的發(fā)病率為5%~15%。大部分蛋白C缺乏癥無明顯的臨床癥狀，2%的蛋白C缺乏癥有明顯而嚴(yán)重的臨床癥狀[1]。 嚴(yán)重的蛋白C缺乏癥會(huì)使凝血與抗凝及纖溶系統(tǒng)發(fā)生紊亂，從而引發(fā)血栓性疾病，如深靜脈血栓形成、彌散性血管內(nèi)凝血等，也有報(bào)道稱蛋白C缺乏與早期流產(chǎn)相關(guān)。目前蛋白C的檢測主要有三種，一是檢測蛋白C的含量；二是檢測蛋白C的功能；三是通過檢測蛋白C基因PROC突變來診斷蛋白C缺乏。本文主要對蛋白C的檢測方法及應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 蛋白C的性質(zhì)及功能

蛋白C是維生素K依賴的血漿蛋白，它主要由肝臟合成，半壽期與凝血因子FⅦ相近，約為6h，比其它的維生素K依賴的凝血因子如FⅡ、FⅨ、FX要短。絲氨酸蛋白酶激活蛋白C，使之成為活化的蛋白C(APC)，APC與血管內(nèi)皮上的內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體結(jié)合[2]。活化蛋白C具有下列功能：(1)滅活凝血因子FVa和FⅧa，降解凝血活酶的形成速度，產(chǎn)生抗凝作用；APC對因子Ⅴa和Ⅷa的滅活作用是迅速的，3μg/ml的APC在3min內(nèi)，可使80%因子FVa、FⅧa滅活[3]；(2)APC能刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放tPA等纖溶酶原激活物，亦能滅活組織纖溶酶原活化抑制物(PAl)，參與促纖溶作用；(3)具酰基水解活性，對多種人工合成底物如S-2238、S-2366等起酰基水解作用。人體內(nèi)血漿蛋白C含量有隨年齡增長而增加的現(xiàn)象，每10年約增加4%[4]。

2 蛋白C基因(P R O C)

蛋白C基因位于染色體2q13-14，其基因序列共有10802個(gè)堿基，含有9個(gè)外顯子(共1790bp)和8個(gè)內(nèi)含子，而編碼蛋白C的外顯子有8個(gè)。該基因的多種突變與蛋白C缺乏癥相關(guān)，目前，報(bào)道其超過300種變異體，且目前沒有發(fā)現(xiàn)明顯的種族及地區(qū)的差異。遺傳型的蛋白C缺乏癥為常染色體的顯性遺傳，75%為單堿基的錯(cuò)義突變或者無義突變，少數(shù)為片段缺失或者插入突變。蛋白C缺乏有兩種表現(xiàn)：一種是蛋白C含量降低，活性降低；而另一種為蛋白C含量正常，而活性降低[5]。后者的變異體多為錯(cuò)義突變(http://www.itb.cnr.it/procmd/)。

3 通過血漿檢測蛋白C缺乏的方法

臨床上蛋白C常用枸櫞酸鈉抗凝血進(jìn)行檢測，國際上首次制定蛋白C檢測的標(biāo)準(zhǔn)品是在1988年，利用凍干的蛋白C作為標(biāo)準(zhǔn)品來校準(zhǔn)各實(shí)驗(yàn)室的儀器[6]。2006年，國際生物制品標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品委員會(huì)(NIBSC)再次對蛋白C的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了校準(zhǔn)，目前，蛋白C檢測具有可溯源的校準(zhǔn)品。早期對蛋白C功能的檢測主要是通過與凝血酶或者血栓調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶的復(fù)合物反應(yīng)，然后通過凝固法或者顯色底物法來檢測活化的蛋白C(APC)。但是此方法復(fù)雜且費(fèi)用昂貴，隨后很多實(shí)驗(yàn)室用免疫電泳法來檢測，但是這種檢測蛋白C抗原的方法不能分析其功能，不適用于蛋白C含量正常而功能下降的Ⅱ型蛋白C缺乏癥的診斷。

現(xiàn)在，蛋白C活性的檢測大多通過商品試劑ProtacR。ProtacR是單鏈的蛋白酶，由銅斑蛇毒純化提取的產(chǎn)物。ProtacR能夠極其快速地激活蛋白C使之成為APC，可以有效地排除蛋白C抑制劑對試驗(yàn)的影響。凝固法的試驗(yàn)是基于APC滅活FVa、FⅧa，從而引起血液凝固時(shí)間的變化，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量蛋白C。顯色底物法是基于顯色底物氨基酸的分解，而測定比色程度來實(shí)現(xiàn)的。目前對于檢測蛋白C缺乏的篩查比較推薦的方法是顯色法，因?yàn)轱@色法干擾因素較少，且比凝固法準(zhǔn)確[7]。

3.1 凝固法檢測蛋白C 測定目標(biāo)為蛋白C的抗凝活性，即對凝血因子FVa、FⅧa的滅活能力。本實(shí)驗(yàn)是一種基于活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)，首先將待檢測的血漿蛋白C稀釋，然后與缺乏蛋白C的血漿混合，加入APTT試劑，最后加入ProtacR。ProtacR將蛋白C激活為APC，APC滅活FVa、FⅧa，最終使APTT延長，檢測結(jié)果可從抗凝時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出，以百分?jǐn)?shù)表示。如FⅧ含量過量以及FV Leiden突變，可導(dǎo)致檢測結(jié)果的假性偏低；如果被檢測血漿中含有狼瘡抗凝物質(zhì)，則檢測結(jié)果假性偏高。這些影響因素可通過顯色底物法來排除，或者結(jié)合抗原含量的檢測來綜合評(píng)估。對于FV Leidenn突變的樣品，可行的方法是將樣本與乏蛋白C血漿按照1:4混合，然后測定混合物蛋白C的活性，但當(dāng)?shù)鞍證含量極低的時(shí)候，會(huì)降低混合血漿檢測方法的靈敏度。目前認(rèn)為肝素含量低于1~2U/ml，不會(huì)影響凝固法的檢測，但是當(dāng)含有阿加曲班、水蛭素、比伐盧定等凝血酶抑制劑時(shí)，會(huì)使檢測結(jié)果假性升高[8]。因此給予APTT的凝固法檢測蛋白C活性的特異性不高一直是此方法的弊端。

凝固法的第二種類型是基于Russell蛇毒凝固時(shí)間(RVV-X)，此方法不受高濃度的FⅧ的影響(<1000U/ml)，且受到狼瘡抗凝物質(zhì)的影響也較小[9]。

凝固法檢測蛋白C的活性是最接近蛋白C真實(shí)的生物功能的一種方法，因此長久以來一直在應(yīng)用，但是此方法的特異性較差，干擾因素較多，因此，在臨床檢測時(shí)要結(jié)合其他的檢測方法來最終確定蛋白C是否缺乏。

3.2 顯色底物法檢測蛋白C底物顯色法通過測定產(chǎn)色底物的吸光度變化來推測所測物質(zhì)的含量和活性的。顯色底物為小分子的寡肽，其通過肽鍵與對硝基苯胺鏈接成為復(fù)合物。在待檢血漿中加入ProtacR，使蛋白C激活為APC，APC作用于上述復(fù)合物中，斷開肽鍵使對硝基苯胺脫落，從而使溶液呈黃色，在波長為405nm下的吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。此方法中針對APC的顯色底物缺乏特異性，也可被其他的酶水解為對氨基苯胺，從而顯色，常見的干擾酶類有凝血酶、活化的FⅩa、激肽釋放酶和組織纖維酶原激活劑等。這些酶類的干擾作用與實(shí)驗(yàn)室對樣本分析條件有關(guān)。目前認(rèn)為APC與底物作用的時(shí)間在5~10min就會(huì)產(chǎn)生非特異性裂解的氨基酸。而在相同的反應(yīng)試劑下，30s的作用時(shí)間則會(huì)產(chǎn)生極少的非特異性產(chǎn)物。在通常的試驗(yàn)中，需要在校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、檢測樣本中加入ProtacR，同時(shí)在另一份校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、檢測樣本中加入水作為空白對照，以空白對照產(chǎn)生的吸光度OD值作為本底OD，但是有學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)反應(yīng)只有30s時(shí)，本底OD是極低的，Khor等對898例樣本進(jìn)行在30s反應(yīng)時(shí)間下有無空白對照的對比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有886例結(jié)果偏差小于3IU/dl，7例偏差在3~5IU/dl之間，4例在4~5IU/dl之間，只有一例偏差為15IU/dl，因此Khor推薦的反應(yīng)模式為：30s反應(yīng)時(shí)間，只有樣本來自DIC患者、含有組織纖溶酶原激活劑的樣本或者采血緩慢的幼兒時(shí)才應(yīng)用空白對照。這樣可排除干擾物質(zhì)的作用，縮短報(bào)告時(shí)間，同時(shí)節(jié)省試劑成本[8]。另外當(dāng)肝素含量不超過2U/ml時(shí)不會(huì)影響檢測結(jié)果，而且凝血酶抑制劑亦不會(huì)影響試驗(yàn)。

3.3 蛋白C抗原含量檢測法 蛋白C抗原檢測是指檢測血漿中蛋白C的含量，而與其是否有活性無關(guān)。通常用到的方法有放射免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。雖然蛋白C抗原檢測對于Ⅱ型蛋白C缺乏癥不敏感，但是，當(dāng)需要鑒別蛋白C缺乏的類型時(shí)，蛋白C抗原的檢測有重要的作用，當(dāng)一樣本蛋白C含量正常，但是活性卻很低的時(shí)候可以考慮其為Ⅱ型。對于用華法林的蛋白C缺乏癥患者，蛋白C抗原的含量結(jié)合FⅦ、FX的水平來診斷其是否為Ⅰ型蛋白C缺乏癥。值得注意的是，此時(shí)要使患者的INR在2~4之間，這樣檢測出來的FⅦ、FX才能與蛋白C進(jìn)行PC/(FⅡ抗原+FX抗原)/2計(jì)算，以比值的方式與正常人做比較。對于存在維生素K抵抗的患者，不能應(yīng)用蛋白C抗原的含量與依賴于維生素K的凝血因子進(jìn)行比值計(jì)算分析[11]。

免疫電泳法檢測蛋白C抗原，需要有特殊的儀器，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長，且電泳時(shí)需要對身體有害的鈣螯合劑，因此目前應(yīng)用較少。

早期ELISA方法受到類風(fēng)濕因子的影響，產(chǎn)生假性的蛋白C升高。De Jager發(fā)現(xiàn)應(yīng)用適當(dāng)?shù)淖钄鄤┛梢员苊忸愶L(fēng)濕因子的干擾。Cooper等應(yīng)用聚乙二醇沉淀法去除了非特異性的結(jié)合，避免了假性升高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，此方法對Ⅱ型蛋白C缺乏癥的檢測有重要的意義[12]。ELISA方法靈敏度高，可以檢測到低于5U/dl的水平，檢測結(jié)果無需推算，可以直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出。

4 基因水平上的蛋白C檢測

遺傳性蛋白C缺乏癥一般認(rèn)為是常染色體顯性遺傳，但部分純合蛋白C缺陷癥患者表現(xiàn)為隱性遺傳。基因檢測蛋白C對于遺傳性家族性蛋白C缺乏癥有重要的診斷價(jià)值，同時(shí)對于產(chǎn)前診斷有重要的意義。另外基因檢測可以對攜帶突變基因的人群進(jìn)行分析。大多數(shù)PROC突變?yōu)殡s合子型，其蛋白C活性與正常人群相近，或略低于正常人，無明顯的臨床癥狀[13]。基因檢測若發(fā)現(xiàn)已經(jīng)明確的變異體類型，則可排除獲得性蛋白C缺乏癥，對臨床診療有重要的作用。目前認(rèn)為基因檢測蛋白C對于血栓形成風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估沒有絕對性的意義，但是對于家族性蛋白C缺乏癥有重要的診斷價(jià)值。

目前已經(jīng)報(bào)道的突變有300多種，高加索人群最常見的為Arg230Cys,Arg178Trp,Gln132X,Val297Met and Pro168Leu，日本報(bào)道的主要突變有Phe139Val,Arg169Trp,Val297Met,Met364Ile,以及G8857del。Q.Ding等對23例中國漢族人群蛋白C缺乏癥進(jìn)行了基因分析，報(bào)道的突變位點(diǎn)為：Glu71 Lys ，Asp170Tyr，Cys175Tyr，Thr337 Ile,Leu386Pro，Trp414X。中國漢族人群蛋白C變異體的類型由于報(bào)道例數(shù)較少，因此尚不完善，有待于進(jìn)一步研究，完成基因背景分析對以后的臨床應(yīng)用有一定的指導(dǎo)作用。

因?yàn)榇蠖鄶?shù)的突變?yōu)辄c(diǎn)突變，因此首先要找到致病突變點(diǎn)，對PROC進(jìn)行全外顯子、剪接位點(diǎn)及啟動(dòng)子進(jìn)行測序。如未發(fā)現(xiàn)致病突變，則需要Southern雜家的方法進(jìn)一步檢測是否有缺失突變，插入突變或者基因重排。一旦找到致病突變，則家系分析就變得容易了，也可以很快的找到攜帶者，并可估算其臨床表現(xiàn)。

人類基因組突變委員會(huì) (HGVS)推薦了檢測DNA、RNA的標(biāo)準(zhǔn)方法，可在http://www.hgvs.org/mutnomen/,nomenclature for the description of sequence variants.中查到相關(guān)信息。另外關(guān)于PROC的參考序列NG_016323.1(genomic),NM_000312.3(mRNA)，NP_000303.1(protein) 可在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/中查到。

5 小結(jié)

蛋白C缺乏的篩選試驗(yàn)建議用顯色底物法，因?yàn)榇朔椒ㄝ^凝固法特異性和準(zhǔn)確度好。2006年P(guān)lebant M對實(shí)驗(yàn)室檢查中的誤差進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)分析前產(chǎn)生的誤差約占 46%~68.2%[14]，2009年Lippi總結(jié)為分析前誤差是實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的主要誤差[15]。蛋白C檢測所需要的標(biāo)本類型為枸櫞酸鈉抗凝血漿，若標(biāo)本中含有凝塊，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果假性升高，如用血清或者肝素抗凝的標(biāo)本，檢測結(jié)果會(huì)偏高，而EDTA抗凝血會(huì)使結(jié)果減低[16]。實(shí)驗(yàn)室在檢測過程中要有室間質(zhì)評(píng)，目前本實(shí)驗(yàn)室采用的室間質(zhì)量控制為美國病理家協(xié)會(huì)(CAP)提供的樣本。在結(jié)果的回報(bào)中包含了數(shù)值和判斷結(jié)果為正常或者異常，這就要求每個(gè)實(shí)驗(yàn)室要有自己的正常人群參考值，可以為自己統(tǒng)計(jì)或者依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果。

顯色底物法較凝固法穩(wěn)定性要好，但實(shí)驗(yàn)室的各種因素仍會(huì)影響其精密度，比如試劑的穩(wěn)定性、分析儀的選擇、環(huán)境因素、操作者的技能等。因此為了降低系統(tǒng)誤差，要定期對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。

值得注意的是蛋白C缺乏的攜帶者其蛋白C活性及抗原數(shù)量與正常人接近，如要對其分析，需要采用蛋白C/[(FⅡ抗原+FⅩ抗原)/2]的比值與正常人群進(jìn)行比較。在急性血栓形成時(shí)檢測的蛋白C是不能判斷其是否為蛋白C缺乏癥的，Kovacs對254例靜脈血栓栓塞患者進(jìn)行了比對試驗(yàn)，在發(fā)生栓塞的24小時(shí)內(nèi)檢測其蛋白C，發(fā)現(xiàn)有10例蛋白C水平極低；對這10例進(jìn)行跟蹤，當(dāng)患者抗血栓治療后，重復(fù)檢測發(fā)現(xiàn)其中的6例蛋白C水平正常[17]。因此在血栓形成傾向的檢測試驗(yàn)中，建議急性血栓時(shí)期蛋白C的檢測結(jié)果僅作為參考，在對此類患者的靜脈血栓治療不應(yīng)考慮蛋白C的結(jié)果[18]。

對于純合子的蛋白C缺乏癥或者新生兒DIC患者，檢測蛋白C時(shí)，其方法的靈敏度下限要小于正常值的5%。有報(bào)道稱ELISA方法的靈敏度最好，可以準(zhǔn)確檢測出小于5%的蛋白C樣本。凝固法分析通常是將樣本進(jìn)行5倍或10倍稀釋，如對于低值樣本，可進(jìn)行2倍或3倍的稀釋，這樣可提高靈敏度。顯色底物法檢測低值樣本其靈敏度是最不理想的，因?yàn)闄z測時(shí)沒有預(yù)稀釋，在低值標(biāo)本中的本底效應(yīng)就會(huì)凸現(xiàn)出來，要將本底排除再進(jìn)行分析。因此在檢測低值樣本時(shí)，首先要確定檢測方法的靈敏度，才能報(bào)告準(zhǔn)確的結(jié)果。

蛋白C檢測結(jié)果較低時(shí)應(yīng)考慮：包括純合子及雜合子在內(nèi)的先天性的蛋白C缺乏；幼兒生理性低值；維生素K缺乏癥；維生素K抵抗；肝臟疾病；腎臟疾病；彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)；靜脈血栓患者；自身免疫性疾病；天冬酰胺酶治療的患者[19]。

總之雖然蛋白C檢測有各種因素的影響，但其在蛋白C缺乏癥的診斷及血栓性疾病的原因分析中有重要的作用。對其基因突變的分析也將成為研究熱點(diǎn)，以彌補(bǔ)中國漢族人群的基因背景，為基因診斷提供依據(jù)。

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