凍干活疫苗中保護(hù)劑的作用及研究

北京天壇生物制品股份有限公司（100024）孫旭東 陳更新

保護(hù)劑是凍干活疫苗中不可或缺的一部分。保護(hù)劑作用有以下幾點(diǎn)：①具有保護(hù)病毒及細(xì)菌活力、抗原穩(wěn)定性、耐干燥和冷凍的低分子物質(zhì)和形成凍干活疫苗耐熱性結(jié)構(gòu)的有機(jī)高分子物質(zhì)；②具有高度抗氧化作用的抗氧化劑，能夠最大限度地消耗溶液中溶解的氧，減少病毒或細(xì)菌與氧的接觸，降低病毒或細(xì)菌的代謝活力和能量損耗，防止其在冷凍干燥及儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中死亡；③根據(jù)保護(hù)劑中的每一種物質(zhì)的共融點(diǎn)進(jìn)行大量反復(fù)凍干試驗(yàn)，科學(xué)地確定每一種活疫苗的凍干曲線，使病毒或細(xì)菌在凍干過(guò)程中的失活率降到最低程度，也使凍干活疫苗形成良好的物理性狀。

1 冷凍干燥技術(shù)介紹

冷凍干燥技術(shù)是目前保持微生物、動(dòng)物組織、細(xì)胞及蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)生物活性的一個(gè)有效的、普遍的方法。在一定的真空條件下，制品溶液預(yù)先凍結(jié)成固體，然后在低溫低壓條件下，從凍結(jié)狀態(tài)不經(jīng)過(guò)液態(tài)而直接升華除去水分的一種干燥方法。此過(guò)程即稱為冷凍干燥，簡(jiǎn)稱凍干，是冷凍和干燥的結(jié)合[1]。

2 冷凍干燥對(duì)疫苗的損傷

在真空冷凍干燥過(guò)程中，冷凍和干燥不可避免地會(huì)造成部分微生物細(xì)胞的損傷及死亡，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性[2]。為提高和保證凍干活疫苗的存活率與生物活性，人們進(jìn)行了大量的研究，其中包括凍干過(guò)程中蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)變化，各種保護(hù)劑對(duì)蛋白質(zhì)的影響。蛋白質(zhì)的折疊與展開(kāi)狀態(tài)的平衡受周圍物理環(huán)境（例如pH值、溫度、溶劑成分、水合水平等）的影響很大。

從二十世紀(jì)六、七十年代開(kāi)始，國(guó)外一些學(xué)者對(duì)凍干蛋白質(zhì)的變性機(jī)理進(jìn)行研究，當(dāng)時(shí)認(rèn)為變性主要發(fā)生在冷凍過(guò)程。從二十世紀(jì)八、九十年代至今，普遍認(rèn)為在冷凍干燥過(guò)程中，冷凍和干燥都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性[3]。冷凍變性機(jī)理是冷凍過(guò)程中結(jié)晶引起水的狀態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，是蛋白質(zhì)變性的主要原因，并且蛋白質(zhì)變性的程度依賴于冷凍的程度，冷凍溫度越低，蛋白質(zhì)變性越劇烈。在低溫下有序的水的結(jié)構(gòu)引起蛋白質(zhì)分子中疏水鍵的破壞是導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的主要原因。蛋白質(zhì)分子周圍分布著多層水分子，在降溫過(guò)程中，蛋白質(zhì)分子周圍的水分子不斷凍結(jié)，但只要蛋白質(zhì)分子表面的單層水分子沒(méi)有凍結(jié)，蛋白質(zhì)就不會(huì)變性，反之亦然。干燥變性機(jī)理是干燥過(guò)程的變性，主要是發(fā)生在二次干燥階段即移去結(jié)合水的階段。蛋白質(zhì)在水溶液中是水化的，表面有一層水分子包圍，構(gòu)成一個(gè)單層分子，這就是水化層。這層水分子通過(guò)氫鍵和蛋白質(zhì)相互作用連接。干燥過(guò)程要移去一部分水化層的水，破壞蛋白質(zhì)表面的氫鍵結(jié)構(gòu)，引起天然結(jié)構(gòu)的變性。

3 保護(hù)劑作用機(jī)理

凍干活疫苗的整個(gè)凍干過(guò)程存在著各種各樣的應(yīng)力，通常包括低溫應(yīng)力、凍結(jié)應(yīng)力（包括枝狀冰晶的形成、離子強(qiáng)度的增加、pH值的改變、相分離等）、干燥應(yīng)力（移去蛋白質(zhì)表面單層水分子）等，這些應(yīng)力常常是直接或間接導(dǎo)致生物制品不穩(wěn)定的因素[4]。保護(hù)劑可以改變疫苗冷凍干燥時(shí)的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥或復(fù)水對(duì)細(xì)胞的損害，盡可能保持生物樣品原有的各種理化特性和生物活性，同時(shí)對(duì)產(chǎn)品貯藏期內(nèi)蛋白質(zhì)變性起到抑制作用[5]。

4 保護(hù)劑介紹

常用在凍干活疫苗中的保護(hù)劑種類有：多羥基化合物、糖、蛋白質(zhì)、聚合物、氨基酸、鹽、表面活性劑等。

4.1多羥基化合物 多羥基化合物是保護(hù)劑中重要成分之一，常見(jiàn)的有甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、側(cè)金盞花醇等[6]。多羥基化合物的保護(hù)機(jī)理：由于疫苗蛋白質(zhì)分子中存在大量的氫鍵，結(jié)合水通過(guò)氫鍵與蛋白質(zhì)分子連接，當(dāng)凍干過(guò)程中脫水后，多羥基化合物的羥基能替代蛋白質(zhì)表面的水分子的羥基，與蛋白質(zhì)表面形成一層假定的水化膜，從而保護(hù)氫鍵的連接位點(diǎn)不直接暴露在周圍環(huán)境中，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)因凍干而變性。

4.2糖 糖是凍干活疫苗中最常見(jiàn)的保護(hù)劑，使用最廣的一類必要成分，為蛋白質(zhì)的非特異性穩(wěn)定劑。在凍干及保存各階段均能對(duì)生物制品起到一定的保護(hù)作用。糖的保護(hù)作用與其及蛋白質(zhì)的種類有關(guān)[7]。常見(jiàn)的有蔗糖、乳糖、海藻糖、菊糖、糊精等。糖的保護(hù)作用：二糖對(duì)阻止蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變、凍干處理過(guò)程中及貯藏期內(nèi)蛋白質(zhì)多肽鏈的伸展和聚集起著顯著作用。二糖中的蔗糖和海藻糖是研究最多、也是公認(rèn)最有效的保護(hù)劑。

4.3蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)保護(hù)劑是保護(hù)劑的重要組分。蛋白質(zhì)類保護(hù)劑根據(jù)來(lái)源可分為兩種：動(dòng)物源性蛋白質(zhì)和外來(lái)蛋白質(zhì)。血清白蛋白是一個(gè)經(jīng)典-優(yōu)良的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，人血清白蛋白則在更低濃度（＜0.05%～0.1%）時(shí)能有效阻止蛋白質(zhì)表面的吸附，對(duì)凍干過(guò)程中多數(shù)蛋白都具有保護(hù)作用。目前，也有報(bào)道稱重組人白蛋白推薦為血清白蛋白的替代品[8]。

4.4聚合物 聚合物作為大分子物質(zhì)保護(hù)劑，要與小分子物質(zhì)聯(lián)合使用，常見(jiàn)的有聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、明膠、聚乙烯亞胺。通常聚合物的穩(wěn)定作用取決于聚合物的多重性質(zhì)，如優(yōu)先從蛋白質(zhì)表面析出、表面活性、使蛋白質(zhì)溶液濃度升高從而阻止其他小分子（如糖及多羥基化合物）的結(jié)晶、抑制冷凍過(guò)程中pH值的劇烈變化等。

4.5氨基酸 氨基酸是蛋白質(zhì)保護(hù)劑常見(jiàn)的一種，常用的氨基酸類保護(hù)劑有精氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸鹽酸鹽、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸等。在冷凍過(guò)程中的主要作用是能升高成品的塌陷溫度，阻止因塌陷而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞[9]。

5 保護(hù)劑的選用

要想獲得穩(wěn)定的活疫苗凍干制品，保護(hù)劑的選用至關(guān)重要。保護(hù)劑的選取對(duì)提高其穩(wěn)定性尤為重要。一個(gè)優(yōu)良的保護(hù)劑要對(duì)保持疫苗的玻璃化有利，因?yàn)椴ＡЩ囊呙绮粌H復(fù)溶速率高，物理性狀好，而且質(zhì)量穩(wěn)定性高。要對(duì)被保護(hù)的疫苗物理化特性有了解，通過(guò)試驗(yàn)摸索出在凍干過(guò)程及貯藏過(guò)程中導(dǎo)致該疫苗不穩(wěn)定的因素。然后針對(duì)這些不穩(wěn)定性因素選擇具體的保護(hù)劑。大量實(shí)驗(yàn)證明，糖及多羥基化合物是最常用的保護(hù)劑。其中蔗糖對(duì)一些蛋白質(zhì)能顯示出很好的保護(hù)作用，故在選取保護(hù)劑時(shí)要優(yōu)先考慮。使用任何一種保護(hù)劑不能對(duì)活疫苗起到所有的保護(hù)，因此還得考慮兩種或兩種以上的保護(hù)劑的使用。在考慮使用多種保護(hù)劑時(shí)，不同種類的保護(hù)劑能起到顯著的保護(hù)效果。此外，原輔材料的選購(gòu)、配制、滅菌、保存和使用，對(duì)于凍干活疫苗的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用，如在保護(hù)劑配制過(guò)程中，使用不同廠家生產(chǎn)的原材料進(jìn)行活疫苗的凍干，結(jié)果可導(dǎo)致疫苗在耐老化試驗(yàn)后效力檢驗(yàn)達(dá)不到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。此外，原輔材料中的雜質(zhì)也會(huì)對(duì)凍干活疫苗的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。保護(hù)劑通常有一個(gè)最佳的使用濃度，所以需要摸索合理的配比使用量。保護(hù)劑的配制對(duì)活疫苗的穩(wěn)定性同樣有重要作用。在配制過(guò)程中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①配制用水的標(biāo)準(zhǔn)；②稱量的準(zhǔn)確度；③保護(hù)劑的溶解順序；④大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)混合比例；⑤保護(hù)劑貯存溫度。以上任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，都可能會(huì)影響保護(hù)劑的性能，導(dǎo)致保護(hù)劑失去保護(hù)病毒的作用，從而導(dǎo)致活疫苗質(zhì)量的不穩(wěn)定。

6 小結(jié)

在凍干前，疫苗要經(jīng)過(guò)配液、過(guò)濾及分裝等過(guò)程，期間疫苗處于水溶液這一相對(duì)不穩(wěn)定狀態(tài)，即使相對(duì)較短時(shí)間，也可能發(fā)生降解反應(yīng)。因此應(yīng)加快各操作步驟，盡量縮短該過(guò)程持續(xù)時(shí)間，以防溶質(zhì)發(fā)生沉淀，進(jìn)而導(dǎo)致疫苗穩(wěn)定性降低。

保護(hù)劑因其獨(dú)特的生產(chǎn)工藝條件，為許多活疫苗特別是對(duì)溫度敏感的抗原和水溶液中不穩(wěn)定的抗原提供了穩(wěn)定的制備方法，發(fā)展十分迅速。但冷凍干燥是一個(gè)伴隨有熱質(zhì)轉(zhuǎn)換發(fā)生的非常復(fù)雜的物理化學(xué)變化過(guò)程，在凍干過(guò)程中冷凍濃集引起的高鹽濃度、pH值變化和干燥失水引起的表面作用都會(huì)對(duì)疫苗抗原結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。除此以外，對(duì)疫苗穩(wěn)定性有重要影響的因素還有水分含量、保護(hù)劑結(jié)晶等。

為了提高活疫苗的穩(wěn)定性，對(duì)凍干生產(chǎn)工藝和保護(hù)劑選擇進(jìn)行了大量的研究，其中保護(hù)劑的選取對(duì)提高其穩(wěn)定性尤為重要。一個(gè)優(yōu)良的保護(hù)劑要對(duì)保持疫苗的玻璃化有利，因?yàn)椴ＡЩ囊呙绮粌H復(fù)溶速率高，物理性狀好，而且質(zhì)量穩(wěn)定性高。目前，已掌握了一些保護(hù)劑的作用機(jī)制，但不同的抗原穩(wěn)定性不同。仍需要進(jìn)一步深入研究保護(hù)劑機(jī)理，最終提供滿足不同條件的有效穩(wěn)定的保護(hù)劑，為生產(chǎn)出質(zhì)量合格穩(wěn)定的凍干活疫苗提供保障。