響應(yīng)曲面法優(yōu)化羊肚菌富硒深層發(fā)酵條件

丁健峰，孫永海，付天宇，謝高鵬

(吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，長春130022)

臨床醫(yī)學(xué)證明，威脅人類健康和生命的四十多種疾病都與人體缺硒有關(guān)［1－4］。硒不能在人體內(nèi)生物合成，必需從體外攝入。我國東北、西北、西南等所屬的15個(gè)省(市、區(qū))土壤含硒量低于臨界值的0.127mg/kg，其不同程度缺硒的縣(市)占全國縣(市)總數(shù)的72%［5］。目前，補(bǔ)硒劑主要有兩類，一類是無機(jī)硒，如亞硒酸鈉、硒酸鈉;另一類是有機(jī)硒，如有機(jī)硒制劑、富硒地區(qū)出產(chǎn)的食物。而無機(jī)硒均有劇毒，一般僅用于醫(yī)藥品而不用于食品，其使用范圍和劑量都受到限制。研究表明，有機(jī)硒化合物毒性遠(yuǎn)低于無機(jī)硒化合物，且生物利用率更高［6］。所以，只有將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，才具有普遍的食用和保健價(jià)值。

食用菌富集的有機(jī)態(tài)微量元素易于人體的吸收利用;且富集的微量元素穩(wěn)定性良好，便于貯存、運(yùn)輸，可以避免其中的某些營養(yǎng)成分損失;攝取的微量元素在限制范圍內(nèi)，亦對(duì)人體無毒副作用［7］。目前人們已利用食用菌為載體培育出富硒靈芝、富硒金針菇、富硒平菇、富硒香菇和富硒猴頭菌等。

但國內(nèi)未見有關(guān)富硒羊肚菌菌絲深層發(fā)酵的報(bào)道。羊肚菌的子實(shí)體和菌絲體均含有豐富的營養(yǎng)成分，其氨基酸含量為食用菌之首，共含有19種氨基酸，是一種高營養(yǎng)低熱量的高級(jí)營養(yǎng)滋補(bǔ)佳品［8］。

鑒于無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的必要性及羊肚菌的藥用保健價(jià)值，本文采用羊肚菌菌絲體作為載體進(jìn)行富硒培養(yǎng)，采用響應(yīng)曲面法建立富硒羊肚菌深層發(fā)酵條件的數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化富硒羊肚菌菌絲的深層發(fā)酵條件。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種

粗柄羊肚菌926號(hào):購于四川綿陽食用菌研究所。

1.1.2 藥品及試劑

土豆、酵母膏、蛋白胨、亞硒酸鈉、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、鹽酸、甲苯、硫酸、瓊脂粉、硝酸、高氯酸、EDTA、鄰苯二胺、硒標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為100μg/ml購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，KH2PO43g/L，MgSO41.5 g/L，水1000 mL，pH值自然。將土豆切成小塊煮沸約30 min煮至熟而不爛為止，四層紗布過濾，再配以其它藥品，定容、混合均勻，分裝后，121℃滅菌30 min，擺斜面放涼備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯10%，蔗糖3%，蛋白胨0.1%，酵母膏0.5%，KH2PO40.05%，MgSO40. 05%。將土豆切成小塊煮沸約30 min煮至熟而不爛為止，四層紗布過濾，再配以其它藥品，定容、混合均勻，裝料量為100 mL/250mL，121℃滅菌30 min，放涼備用。

1.2 試驗(yàn)儀器

電子萬用爐，天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn);GB204型分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司生產(chǎn);SP－250C型恒溫恒濕箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);DSX－280A型不銹鋼手提式滅菌器，上海市申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn); PHS－3D型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);HZQ－C空氣浴振蕩器，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn);CSF－1A型超聲波發(fā)生器，上海超聲儀器廠生產(chǎn);UV2300分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 富硒羊肚菌菌絲生物量的測定

菌絲生物量計(jì)算公式

式中:X為菌絲生物量，g/L;M為菌絲球干燥后的質(zhì)量，g;V為發(fā)酵液的體積，L。

1.3.2 硒含量的測定

硒含量的檢測采用鄰苯二胺紫外分光光度法［9］，鄰苯二胺在酸性介質(zhì)中與亞硒酸鹽反應(yīng)生成3，4－苯并－1，2，5－重氮苤硒腦，用甲苯萃取，利用紫外分光光度計(jì)在335nm處測定萃取液的吸光度。

樣品處理:精確稱取一定量的樣品，研磨后放入磨口三角瓶中，加入濃硫酸10.0 mL，潤濕樣品，再加入濃硝酸－高氯酸(2:1)混合酸20.0 mL，放置過夜［10］。次日水浴加熱至棕黃色的NO2氣體產(chǎn)生，溶液變?yōu)樽攸S色后，繼續(xù)加熱，到白煙除盡為止，加入10.0 mL(濃鹽酸:蒸餾水=1:9)的鹽酸，繼續(xù)加熱5分鐘，即達(dá)到消化終點(diǎn)。取10. 0mL消化液與錐形瓶中，加水30.0mL，分別加入5%EDTA 2.0 mL和1%鄰苯二胺2.0 mL，用HCI調(diào)節(jié)溶液pH至2.0，混勻后室溫避光放置60 min，加入10.0 mL甲苯，大力振蕩4min，移入分液漏斗中靜置4 min。在335 nm波長下測定試液的吸光度，以空白樣做對(duì)比，測定試液的吸光度，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線求出硒濃度。

硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:配置濃度為0.00，3.00，6.00，9.00，12.00，15.00，18.00，21.00μg/ml的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以硒含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 硒含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve of selenium

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為

式中:x為吸光度，A;Y為硒含量，μg/ml。

硒含量的測定與計(jì)算:將樣品消化后的待測液以適當(dāng)倍數(shù)稀釋，同樣條件下測定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出測試液的硒濃度。

1.4 試驗(yàn)方案

1.4.1 單因素試驗(yàn)

研究發(fā)酵時(shí)間(2、3、4、5、6 d)、培養(yǎng)溫度(22、24、26、28、30℃)、硒濃度(20、50、80、110、140μg/ml)以及搖床轉(zhuǎn)速(60、80、100、120、140 r/min)4個(gè)主要因素對(duì)富硒羊肚菌菌絲生物量和硒含量的影響情況。

1.4.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用Design－Expert數(shù)據(jù)分析軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，利用響應(yīng)面分析法確定富硒羊肚菌的最佳發(fā)酵條件，做出二次回歸方程、響應(yīng)面立體圖和等高線圖，確定最佳的發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)富硒羊肚菌菌絲生物量的影響

羊肚菌進(jìn)行深層發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，菌種接入一天后開始緩慢生長，到第五天末開始出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，菌絲體干重略有減少，如圖2所示。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)羊肚菌菌絲生物量的影響Fig.2 Effect of time speed on M orchella esculentam ycelia biomass

2.1.2 培養(yǎng)溫度對(duì)富硒羊肚菌菌絲生物量的影響

選擇5個(gè)培養(yǎng)溫度梯度培養(yǎng)，富硒羊肚菌菌絲生物量的變化如圖3所示。由圖3可知，羊肚菌在22～30℃這一較大的溫度范圍內(nèi)都可以生長，26℃菌絲體生長最好，但是隨著溫度的進(jìn)一步升高，得到的菌絲生物量明顯降低。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)羊肚菌菌絲生物量的影響Fig.3 Effect of culture tem perature on M orchella esculentam ycelia biomass

2.1.3 硒濃度對(duì)富硒羊肚菌菌絲生物量的影響

本試驗(yàn)中，對(duì)硒的富集情況進(jìn)行了初步的研究。從圖4可以看出，硒對(duì)羊肚菌菌絲體的生長影響比較大，低濃度的硒對(duì)羊肚菌的生長有促進(jìn)作用，但當(dāng)硒的濃度超過80μg/m l時(shí)，隨著培養(yǎng)基中硒濃度的增加，菌絲生物量是逐漸降低的。

2.1.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)富硒羊肚菌菌絲生物量的影響

選擇5個(gè)轉(zhuǎn)速梯度培養(yǎng)，富硒羊肚菌菌絲生物量的變化如圖5所示。從圖5中可以看出，在中等轉(zhuǎn)速100 r/min下所得到的菌絲生物量較高，且在80 r/min到120 r/min之間的轉(zhuǎn)速對(duì)羊肚菌菌絲生物量無顯著影響。因此，本試驗(yàn)選擇搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min。

圖4 硒濃度對(duì)羊肚菌菌絲生物量的影響Fig.4 Effect of Se concentration on M orchella esculenta m ycelia biomass

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)羊肚菌菌絲生物量的影響Fig.5 Effect of shaking speed on M orchella esculenta mycelia biomass

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件

選取發(fā)酵時(shí)間(X1)、培養(yǎng)溫度(X2)、硒濃度(X3)作為試驗(yàn)因子，富硒羊肚菌菌絲生物量(Y1)、硒含量(Y2)為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化富硒羊肚菌發(fā)酵條件。其試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素編碼如表1所示，Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表3可見該模型的方差分析，該模型極顯著(P＜00001)，一次項(xiàng)中X1、X3達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01);二次項(xiàng)中X1、X2、X3對(duì)菌絲生物量的影響都是極顯著(P＜0.01);交互項(xiàng)中X1和 X3、X2和X3對(duì)菌絲生物量有顯著性(R＜0.25)影響，而X1和X2交互作用不顯著。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素編碼Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken design

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 3 Coefficients of themodel and ANOVA

表4 模型可信度分析Table 4 Reliability of the model

建立二次響應(yīng)面模型，以菌絲生物量為響應(yīng)值Y(g/L)，經(jīng)二次回歸擬合后得到響應(yīng)函數(shù)，即回歸方程為:

通過模型可信度分析表可以看出，在用公式(3)描述各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，線性關(guān)系顯著(R2=0.9990)。由模型的方差分析表可以得到，模型的顯著水平P＜0.0001，此時(shí)回歸方差模型是極其顯著的，這種試驗(yàn)方法是可靠的。通過表4的模型可信度分析可以看出各個(gè)因素值和響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用此模型來函數(shù)化，可以用此回歸方程來對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析預(yù)測。

通過回歸方程來繪制分析圖，以考察所擬合響應(yīng)曲面的形狀，響應(yīng)曲面立體分析圖和相應(yīng)等高線圖見圖6。

從圖6中可以看出，溫度和時(shí)間對(duì)菌絲生物量的影響都不太顯著，兩個(gè)曲面都比較平緩。等高線圖表明沿時(shí)間軸線等高線密集，說明時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響比溫度顯著。等高線成橢圓形說明兩者交互作用顯著。

圖7顯示，硒濃度對(duì)菌絲生物量的影響顯著，曲面較陡，隨著硒濃度高于80μg/mL后曲面相對(duì)變緩，可能已經(jīng)達(dá)到羊肚菌的富集能力極限，時(shí)間對(duì)于菌絲生物量的影響不顯著，曲面平緩，等高線呈現(xiàn)出橢圓形，說明交互作用較強(qiáng)，影響顯著。

從圖8中可以看出，硒濃度對(duì)菌絲生物量的影響顯著，曲面較陡，溫度對(duì)菌絲生物量的影響不太顯著，曲面相對(duì)緩和。由溫度和硒濃度的交互作用等高線可知，沿硒濃度軸線等高線密集，而溫度軸向等高線較稀疏，說明硒濃度對(duì)響應(yīng)值峰值影響比溫度大，等高線呈橢圓形說明，兩者交互作用顯著，影響顯著。

圖6 Y=f(X1，X2)響應(yīng)面立體圖和等高線圖ig.6 Three-dimensional response surface graphs and the contour p lots of extraction time versus ultrosonic power according to Y=f(X1，X2)

圖7 Y=f(X1，X3)響應(yīng)面立體圖和等高線圖Fig.7 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of extraction time versus ultrosonic power according to Y=f(X1，X3)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，在優(yōu)化的反應(yīng)條件下進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)三次，得到菌絲生物量為10. 339 g/L，得到驗(yàn)證值與實(shí)際值的相對(duì)誤差僅為0. 60%。回歸方程所得硒產(chǎn)量的預(yù)測值與驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值相接近，說明回歸方程能夠較真實(shí)地反映篩選因素對(duì)富硒羊肚菌菌絲生物量的影響，應(yīng)用響應(yīng)面法可以達(dá)到優(yōu)化富硒羊肚菌深層發(fā)酵條件的目的。

圖8 Y=f(X2，X3)響應(yīng)面立體圖和等高線圖Fig.8 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of extraction time versus ultrosonic power according to Y=f(X2，X3)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用單因素試驗(yàn)，研究了發(fā)酵時(shí)間、硒濃度、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)富硒羊肚菌菌絲生物量的影響，利用響應(yīng)曲面法對(duì)富硒羊肚菌菌絲深層發(fā)酵的條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度25.73℃、發(fā)酵時(shí)間為5.22 d、硒濃度為86.67μg/ml在此條件下富硒羊肚菌菌絲生物量的理論值達(dá)10.512 g/L，硒含量達(dá)到18.8μg/ m l，實(shí)際菌絲生物量的達(dá)到10.339 g/L、硒含量達(dá)到18.6μg/ml。

［1］Mahan D C.Effects of seleniumr enriched yeastand sodium selenite on tissue selenium retentin and serum glutathione peroxidase activity in grower and finisher swine［J］.JAnim Sci，1999，74:2967－2974.

［2］John Weldon Finley.The absorption and tissue distribution of selenium from high－selenium broccoli are different from selenium sodium selenite，sodium selenate and selenomethionine as determined in selenium－deficient rats［J］.JAgic Food Chem，1998，46:3702－3707.

［3］姚莉，段玉峰.微量元素硒與人體健康［J］.中國食物與營養(yǎng)，2004，7:50－52.

Yao Li，Duan Yu－feng.Selenium and health［J］.Food and Nutrition In China，2004，7:50－52.

［4］常海波，孫鳳春，楚玉彪.微量元素硒與人體健康的研究［J］.世界元素醫(yī)學(xué)，2006，13(2):22－23.

Chang Hai－bo，Sun Feng－chun，Chu Yu－biao.Study on the relationship between Se and human health［J］. World Elemental Medlcine，2006，13(2):22－23.

［5］宮麗，馬光.硒元素與健康［J］.環(huán)境科學(xué)與管理，2007，32(9):32－35.

Gong Li，Ma Guang.The selenium elemental and health［J］.Environmental Science and Management，2007，32(9):32－35.

［6］Rayman M.The importance of selenium to human health［J］.Lancet，2000，356:233－241.

［7］暴增海，馬桂珍，徐曉紅.微量元素對(duì)食用菌產(chǎn)量和品質(zhì)的影響［J］.世界農(nóng)業(yè)，2002，7:38－40.

Bao Zeng－h(huán)ai，Ma Gui－zhen，Xu Xiao－h(huán)ong.Effects of microelement on the yield and quality of edible fungi［J］.World Agriculture，2002，7:38－40.

［8］魏蕓，張?zhí)煊樱瑥堟?羊肚菌多糖的分離純化及組成結(jié)構(gòu)分析［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2000，4 (04):36－37.

Wei Yun，Zhang Tian－you，Zhang Shu，et al.Isolation，purification and characterization of polysaccharides from Morchella essulenta L.［J］.Journal of plant resources and Environment，2000，4(04):36－37.

［9］張?jiān)拢婙Q，林景衛(wèi)，等.紫外分光光度法測定蛹蟲草菌絲體中硒的含量［J］.微量元素與健康研究，2010，5:21－23.

Zhang Yue，Zhong Ming，Lin Jing－Wei，et al.Ultraviolet spectrophotometry determine selenium content in cordycepsmilitarismycelium［J］.Studies of Trace Elements and Health，2010，5:21－23.

［10］周躍花，楊菊香，張娜.紫外分光光度法測定紫陽富硒茶中的硒［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18(4);229－232.

Zhou Yue－h(huán)ua，Yang Ju－xiang，Zhang Na.Determination of selenium of enriched tea in ziyang by UV spectrophotometry［J］.Acta Agriculturae Boreali－Occidentalis Sinica，2009，18(4);229－232.

［11］張潤楚，鄧海濤，蘭燕，等.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析及參數(shù)優(yōu)化［M］.北京:中國統(tǒng)計(jì)出版社，2003:346－350.