組織工程化膽管的研究進展＊

毛晶晶 綜述，李文春審校

（湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院，湖北十堰442000）

臨床上由于醫(yī)源性膽管損傷、膽管結(jié)石、膽管腫瘤、膽管感染等原因?qū)е碌牡母瓮饽懝塥M窄以及一些先天性膽管疾病的治療，常用膽腸吻合內(nèi)引流術或外引流術等方法處理，由于這些手術需要把膽管切除或者切開，再行各種方式的膽腸吻合，使得膽管、Oddis括約肌的結(jié)構缺損或者功能損害，術后發(fā)生膽漏、膽管阻塞、膽管感染甚至膽汁性肝硬化等并發(fā)癥的風險極大增高［1-3］。這使得尋找一種合適的能夠代替膽管和Oddi括約肌結(jié)構和功能的人工膽管變得非常有必要，從而順利解決肝外膽管修復和重建的難題。隨著20世紀80年代以來組織工程學的發(fā)展，組織工程化膽管的應用推動了膽管替代治療的進程［4］。組織工程的3個關鍵要素由支架材料、種子細胞以及細胞和材料的復合組成［5-7］，這使得組織工程化膽管中支架材料以及種子細胞的選擇至關重要，本文就組織工程中3個關鍵要素進行綜述。

1 支架材料

目前組織工程化膽管中的支架材料大致有人工合成和生物源性兩種［8］。人工合成的支架材料目前用于臨床的有高分子多聚物材料、合金類材料。研究者們就這些材料開展了廣泛的動物實驗。

1.1 人工合成的不可降解吸收型的高分子材料支架 不可降解吸收型的高分子材料支架如聚四氟乙烯（PTFE）、聚羥基乙酸（PGA）、聚L-乳酸（PLLA）、乳酸和乙醇酸共聚物（PLGA）等。這些材料部分已用于臨床。Zografakis等［9］采用鐵氟龍（商品名，為PTFE）制成的材料植入動物狗體內(nèi)，剖腹探查發(fā)現(xiàn)所有動物血清的堿性磷酸酶（ALP）、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）均有升高，在材料植入膽管內(nèi)時表現(xiàn)出的生物相容性微乎其微，但是在膽管和周圍的組織中并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的炎癥反應。作為在體內(nèi)不可降解性材料，氟橡膠246B、PTFE、聚氨酯熱塑性彈性體TPE-80B，它們在體內(nèi)長期留存是否對膽管細胞的生長分化產(chǎn)生影響，是否會釋放有毒物質(zhì)，遠期療效有待觀察。

1.2 人工合成的可降解的多聚物材料 人工合成的可降解的多聚物材料也成為國內(nèi)外學者的研究熱點。Aikawa等［10］用可降解的聚合物（BAP）作為膽管缺損的替代物，將豬的正常膽管壁呈梭形的部分被切開，再將BAP補片植入切開位點，剖腹探查植入位點的修復情況，以及觀察BAP是否發(fā)生了變形；在補片植入和后續(xù)剖腹手術時均從動物體內(nèi)取血進行生化分析；結(jié)果顯示所有植入了BAP的實驗用豬均存活至宰殺，而且體質(zhì)量都有增加，也無黃疸跡象；進行了BAP修補的豬膽管未出現(xiàn)梗阻，血生化分析也提示沒有肝膽酶活動的增加；組織學觀察，顯示在新生膽管內(nèi)出現(xiàn)了腺體結(jié)構；BAP和豬自體膽管幾乎融為一體不能辨別，體內(nèi)膽管造影術顯示植入位點的膽管擴張，肝內(nèi)膽管卻沒有，血生化分析顯示在正常水平之內(nèi)，組織學觀察證實在植入補片的位置有類似自體膽管的立體圓柱形上皮細胞生長；由此提出此替代物有作為新型膽管損傷治療的潛在前景。

1.3 合金類支架 合金類的支架目前也有部分應用于臨床，但是植入后引起較大的排斥反應，長期置于體內(nèi)不利于細胞的生長和分化，而且硬度高，缺乏韌性，不利于手術縫合，易脫落，制造成本高，應用受限。

1.4 可降解的生物源性支架 隨著組織工程學研究的進一步深入，可降解的生物源性的支架逐漸被研究者們運用于動物實驗進行探查。這類材料有的取材于人體其他部位組織，但是需要再次手術取材，增加了患者的疼痛和創(chuàng)傷，目前研究多集中于動物實驗的探討。Capitanich等［11］將大白鼠膽管切除3mm，再用自體靜脈進行修補，在術后1、2、3個月時對各組大白鼠行膽管造影術，再次剖腹手術以及血液測試，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)膽汁淤滯，移植替代物表面有類似膽管上皮細胞生長，但尚需更多實驗以及臨床研究才能支持自體靜脈可以作為膽管缺損修補的替代物這一結(jié)論。也有的取材于動物組織，如豬的小腸黏膜下層，這類去除細胞的細胞外基質(zhì)具有豐富的膠原蛋白和彈性蛋白，沒有免疫源性，和機體無排斥反應，內(nèi)部結(jié)構呈三維性，富含孔洞，有利于細胞深入內(nèi)層生長，國外Rosen等學者將豬的小腸黏膜下層植入狗體內(nèi)，作為膽管修復的材料，結(jié)果證明，這類材料不僅可在狗體內(nèi)降解，還能使新生成的細胞和組織成分具有植入時的形態(tài)，產(chǎn)生的炎性因子也很少［12］。Miyazawa等［13］報道可吸收的生物源性的管狀支架在作為膽管旁路植入肝外膽管時，使膽管細胞在接入位點開始再生修復，并且一直延續(xù)到這個人工膽管降解和吸收，這種人工膽管的發(fā)現(xiàn)可能會促進膽管疾病治療的研究發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，可降解型的生物源性的支架植入體內(nèi)后，不僅可以緩慢分解，降解后產(chǎn)物對機體無害，最后還可以被組織吸收；同時對自體組織不會產(chǎn)生刺激，不會損傷膽管內(nèi)壁的黏膜和細胞，還可以使組織生長維持植入時的形態(tài)，利于膽管上皮細胞的黏附生長，能夠?qū)⒛懼^好地引流，減少膽汁淤滯，這使得其具有良好的臨床應用價值。從長遠考慮，可降解性的生物源性的支架相比人工合成的高分子材料和合金類的支架具有明顯的優(yōu)勢。

2 種子細胞

種子細胞一般來源于在體外具有多向分化能力的各種干細胞，易于分離獲取，具有無限自我復制及增殖功能，它們貼附在支架材料表面以及內(nèi)層結(jié)構生長，能發(fā)揮組織工程血管、瓣膜或膽管等所要替代的正常組織的生理功能。

骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）擁有很強的向各種來自三胚層的細胞分化的能力，它在體外還能高度擴增，使得細胞移植和組織工程領域的學者們對其逐漸關注［14］。最近研究表明，骨髓基質(zhì)干細胞能極大地促進肝細胞和膽管細胞生長，還具有向肝細胞和膽管細胞分化的潛能，同時，這些細胞不會引起移植排斥反應，不會產(chǎn)生免疫抑制的不良反應［15］。Lin等［16］將BMSCs誘導分化成肝細胞和膽管細胞，并分別對其進行鑒定，后進一步的措施是在動物實驗中，把分化提純的膽管細胞通過內(nèi)窺鏡注射入膽漏的部位，檢測動物血中的膽紅素，并用超聲掃描動物腹部，觀察植入的膽管細胞是否可以治療膽漏，然而動物實驗有待證實。徐勇等［17］在體外分離培養(yǎng)大鼠的MSCs，并用細胞生長因子將其誘導分化為膽管的平滑肌細胞和膽管上皮細胞，和羥基PLGA復合培養(yǎng)，顯示細胞生長良好，還能分泌細胞外基質(zhì)。這些研究均提示BMSCs具有作為組織工程化膽管種子細胞的應用價值，但由于組織工程化膽管研究目前也屬于新興的研究課題，對種子細胞的關注較少，關于種子細胞的選擇仍有待考察。

3 支架和種子細胞的復合培養(yǎng)

支架和種子細胞的相容性也是組織工程技術研究的一大課題。成功的組織工程化膽管應是種子細胞能在膽管支架上貼附和深入生長，并能發(fā)揮所替代的細胞的功能，和機體良好相容，不發(fā)生免疫排斥反應，膽汁流動通暢，不發(fā)生堵塞，也無膽漏，能長期留存于機體，無不良反應［18-20］。

組織工程器官的構建，即細胞與支架材料的復合是組織工程的關鍵［21］。將種子細胞種植在具有特定幾何形狀的支架材料上，使種子細胞黏附、鋪展、生長、分化成具有特定功能的、幾何形狀與細胞支架相似的組織和器官。常用的構建組織工程化膽管的有兩種方法：體外構建和體內(nèi)構建。體外構建是在體外將種子細胞種植在膽管支架之上，復合培養(yǎng)至種子細胞分化成熟具有功能后，再移入機體內(nèi)。體內(nèi)構建是將支架材料先放入機體內(nèi)，待自體細胞貼附其上生長。目前多用的是第2種方式。體外構建組織工程化膽管難度較高，支架材料和種子細胞的要求高，且膽管處于流體環(huán)境之中。種子細胞在體外與支架復合后具有良好的活力，但它們均是將細胞與支架材料在靜止狀態(tài)、無特殊壓力和環(huán)境變化的條件下進行的培養(yǎng)，即靜態(tài)培養(yǎng)，缺點是不具備膽汁流、膽管壓力等實際生理環(huán)境，制成的組織工程化膽管結(jié)構紊亂、力學強度低、抗感染能力差，臨床使用可行性差。種子細胞與支架材料的復合的動態(tài)培養(yǎng)模式將是構建組織工程器官的發(fā)展趨勢［22］。動態(tài)培養(yǎng)可提供符合生理條件的培養(yǎng)環(huán)境，促進平滑肌細胞定向排列，細胞外基質(zhì)分泌和膠原重構，使組織工程化膽管具有生物活性、其結(jié)構和功能與自體膽管相類似的人工膽管，增強臨床應用的可行性。

4 結(jié) 語

組織工程化膽管作為一門新的研究課題，人們對其研究多限于動物實驗，臨床應用開展少。但近年來對膽管支架材料的選擇及制備進行了廣泛的動物實驗，取得了一些進展，還有學者已開始利用大動物做實驗，但是仍處于起步階段，隨著人們對各種支架材料的來源的探討，對種子細胞的選擇，關于組織工程化膽管的認識逐漸深入，相信在將來能制成具有真正臨床應用價值的組織工程化膽管，為廣大肝膽疾病患者帶來福音。

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