mda－9／Syntenin在腫瘤轉移過程中的作用

譚 云 綜述，鐘 東 審校

（重慶醫科大學附屬第一醫院神經外科 400016）

含有PDZ結構域的蛋白屬于支架蛋白，在信號轉導級聯反應中起承上啟下的作用，在細胞分裂、蛋白質運輸及降解、基因表達等多種體內重要的生物學過程中發揮關鍵作用。PDZ是由最早發現含有此結構域的post－synaptic density protein－95，drosophila disc large tumor suppressor，zonula occludens－13種蛋白質首字母的縮寫而得名，由80～90個氨基酸組成，包含兩個α螺旋和6個β折疊。黑色素瘤分化相關基因mda－9／Syntenin是PDZ結構域蛋白家族成員之一，其通過特異性的定位調控體內多種分子事件。本文主要就含PDZ結構域的mda－9／Syntenin在腫瘤的侵襲，轉移過程中的作用及其機制進行綜述。

1 mda－9／Syntenin的克隆及與分布

黑色素瘤分化相關基因9（mda－9）是首先在人黑色素瘤細胞中作為差異表達基因被克隆出來。采用干擾素β（IFN－β）和蛋白激酶C激動劑mezerein聯合治療可重新啟動人黑色素瘤細胞的終末分化過程，并伴隨著其增殖能力的永久性喪失、黑色素合成增加、細胞表面抗原和表達基因改變以及細胞形態趨于正常黑色素細胞等變化。通過減差雜交技術對正常和終末分化人黑色素瘤細胞的比較，進一步確定了黑色素瘤分化相關基因9（mda－9）的表達。mda－9cDNA全長約2.1kb，其開放閱讀框架含有894bp，編碼298個氨基酸，預測相對分子量約為33×103，具有PDZ－1和PDZ－22個PDZ結構域，這一基因隨后被克隆并重新命名為Syntenin。

2 mda－9／Syntenin與腫瘤轉移的關系及其分子機制

惡性腫瘤細胞具有向遠處組織侵襲并形成轉移灶的能力。這一過程首先需要腫瘤細胞黏附到多種基質蛋白上，然后通過基質金屬蛋白酶（MMP）降解細胞外基質，隨后遷移進入周圍的間質中。抑制消減雜交技術對非轉移性乳腺癌細胞株MCF－7和轉移性乳腺癌細胞株 MDA－MB－435進行研究后發現，mda－9／Syntenin在轉移性乳腺癌細胞株中呈過表達。最近的研究發現，MDA－MB－435細胞系是由M14黑色素瘤細胞系衍生的而并非是一種原發的乳腺癌細胞系，提示mda－9／Syntenin的表達可能與腫瘤細胞的轉移有關［1］。與原發性或者非轉移性腫瘤相比，多種轉移性乳腺癌和消化道腫瘤細胞系中均發現mda－9／Syntenin的過表達；通過促使非轉移性的乳腺癌細胞 MCF－7以及消化系統腫瘤細胞 Az－521過表達 mda－9／Syntenin后發現，細胞伴隨著偽足形成增加等形態學改變，腫瘤細胞遷移和侵襲的能力明顯增強。mda－9／Syntenin結構域缺失分析的結果顯示，PDZ－2結構域是該基因促進細胞遷移運動的有效結構域。

對原發性黑色素瘤和轉移性黑色素瘤的研究發現，mda－9／Syntenin的表達隨腫瘤轉移的進展而上調［2］。免疫組織化學分析結果顯示，黑色素細胞向原發性黑色素瘤進展過程中都表現出mda－9／Syntenin表達水平逐漸增加的趨勢［3］。采用分泌蛋白質組生物標記技術在轉移性黑色素瘤病人的葡萄膜黑色素瘤細胞中亦檢測到mda－9／Syntenin的表達［4］。臨床研究發現，9個正常皮膚樣本中均未見mda－9／Syntenin表達，15個皮膚痣中僅檢測到1例mda－9／Syntenin的陽性表達，30個垂直生長期原發性黑色素瘤中有24例表達mda－9／Syntenin，12個轉移淋巴結中有8個呈陽性表達，提示mda－9／Syntenin的表達隨腫瘤的進展顯著增加；體外研究同時發現高轉移性腫瘤細胞T1P26中mda－9／Syntenin的表達顯著高于低轉移性腫瘤細胞系M4Beu，明確了mda－9／Syntenin具有參與調節腫瘤轉移過程的能力［5］。將重組 mda－9／Syntenin腺病毒（Ad.mda－9／S）轉染低轉移性FM516－SV和M4Beu細胞后發現，腫瘤細胞的遷移、侵襲以及錨定依賴性生長能力顯著增加；而轉染重組反義 mda－9／Syntenin腺病毒（Ad.mda－9／AS）的高轉移性腫瘤細胞T1P26惡性生物學特征受到明顯抑制。將穩定轉染mda－9／Syntenin的FM516－SV和M4Beu細胞通過皮下注射方式植入到免疫能力低下的新生大鼠體內可顯著增加其自發性肺轉移的能力，而在相同實驗條件下轉染重組反義mda－9／Syntenin的T1P26細胞自發性肺轉移的能力明顯下降，進一步證實了mda－9／Syntenin在調節腫瘤轉移過程中的關鍵作用［6］。

分子結構分析發現，mda－9／Syntenin調節黑色素瘤轉移的過程可能是通過黏著斑激酶（FAK），p38絲裂原激活蛋白激酶（p38MAPK），c－JNK，核因子κB（NF－κB）和膜型基質金屬蛋白酶－1（MT1－MMP）信號通路介導的［6－7］。mda－9／Syntenin具有優先與纖維連接蛋白信號相互作用的特點，將過表達mda－9／Syntenin的FM516－SV和 M4Beu細胞接種到纖維連接蛋白上，可產生更多的肌動蛋白應力纖維。而表達反義mda－9／Syntenin的T1P26細胞中肌動蛋白微絲和黏著斑的形成減少。提示mda－9／Syntenin表達引起的細胞骨架組成和形態的改變可能與黏著斑激酶FAK相關。FAK是整合素相關信號通路的關鍵成份，在調節腫瘤細胞運動和侵襲過程中具有重要作用。在低轉移性M4Beu細胞中過表達mda－9／Syntenin可見磷酸化的FAK顯著增加，而在高轉移性T1P26細胞中下調mda－9／Syntenin的表達則伴隨著FAK磷酸化作用的明顯減少。共聚焦研究顯示，WM1341D黑色素瘤細胞中mda－9／Syntenin與磷酸化的FAK共表達；在纖維連接蛋白上，mda－9／Syntenin促進FAK的磷酸化，繼而激活 MAPK、c－Jun氨基末端激酶（JUK）以及 NF－κB；采用 FAK，p38MAPK，JNK 或者NF－κB任一信號分子的抑制劑處理后，均可顯著抑制mda－9／Syntenin增加細胞遷移和侵襲能力的特性。人色素瘤細胞中mda－9／Syntenin通過活化 NF－κB和 MT1－MMP而啟動后續的信號級聯反應并通過以下模式促進腫瘤的轉移：腫瘤細胞與細胞外基質（ECM）結合后，mda－9／Syntenin誘導 FAK 的磷酸化，后者通過磷酸化作用激活p38MAPK，進而引起IκB的降解以及胞漿中p65與p50解聚后與靶基因MT1－MMP結合，大量產生的MT1－MMP與TIMP－2結合后活化pro MMP－2進而產生MMP－2，從而引起腫瘤細胞的運動、侵襲以及生長能力增加［7］。然而在乳腺癌細胞中，mda－9／Syntenin并不能誘導MMP－2或者MMP－9的產生。由于上述觀察到的黑色素瘤細胞表現都是種植在纖維連接蛋白上的，因此這一差異可能與細胞類型以及ECM的誘導信號有關。

然而，在FAK的C末端序列中也未能發現與PDZ結構域結合的基序，提示mda－9／Syntenin可能與黏著斑中調節黏著斑激酶磷酸化作用的其他成份發生作用。因此，確定mda－9／Syntenin激活FAK過程中的關鍵作用蛋白，以及后續的信號事件是了解這一接頭蛋白控制腫瘤轉移過程的分子的關鍵。Boukerche等［8－9］發現了mda－9／Syntenin首先激活c－Src介導c－Src／FAK信號復合體大量聚集在細胞膜上，通過FAK的自身磷酸化作用放大后續信號或者 mda－9／Syntenin激活c－Src后形成的 mda－9／Syntenin／c－Src復合體直接與 NF－κB作用以發揮其促進腫瘤侵襲和轉移的能力。Hwangbo等［10］認為FN首先激活 mda－9／Syntenin，其通過PDZ結構域與PKCα對話激活FAK及其后續信號途徑發揮其促進腫瘤侵襲和轉移的作用。

缺失突變分析結果顯示，在HEK 293T向I型膠原侵襲過程中需要mda－9／Syntenin 2個PDZ結構域的共同作用；而在乳腺癌細胞中PDZ－2結構域在mda－9／Syntenin功能中占據了主導地位。晶體學研究顯示，PDZ－1結構域K124，R128和K130突變體在多肽結合界面周圍形成一個高度正電荷的表面有利于脂類結合，這一界面可抑制mda－9／Syntenin與磷酸肌醇的結合及其侵襲作用的發揮。mda－9／Syntenin的這一突變并不影響其與syndecan－2的相互作用卻明顯干擾其與抑癌蛋白 merlin／schwannomin－1（sch－1）的相互作用，提示與之結合的配體（脂類／多肽）對 mda－9／Syntenin的功能具有調節作用［11］。研究發現，mda－9／Syntenin介導I型膠原侵襲作用的增加過程需要Rho家族中小的 GTPases，RhoA，cdc42，Rac－1以及活化的H－ras參與，作為Ras下游信號的磷脂酰肌醇－3激酶（PI3K）／Akt以及 MAPK通路在 mda－9／Syntenin誘導的侵襲作用中發揮重要作用［12］。mda－9／Syntenin過表達可導致Akt S473和胞外信號調節激酶（ERK）－1／2的磷酸化作用增加。然而，抑制p38MAPK或者JNK對于mda－9／Syntenin誘導的I型膠原上的侵襲作用沒有任何影響。由此可見，ECM不同成分的相互作用可通過相應的信號途徑影響mda－9／Syntenin的表達及其后續的信號級聯反應，但mda－9／Syntenin表達的最終結果都會導致細胞遷移和侵襲能力增加。

3 mda－9／Syntenin與腫瘤相關蛋白的作用

大量mda－9／Syntenin調節Syndecans循環研究發現Syndecans可調節腫瘤細胞的增殖，黏附及運動能力，從而成為判定腫瘤進展和病人存活的指標。Syndecan－1參與了 Wnt－1誘導的小鼠乳腺癌的發生，并可促進肺鱗癌細胞的轉移。在胰腺癌、消化道腫瘤、乳腺癌和黑色素瘤中均觀察到Syndecan－1表達上調；在肝細胞癌和惡性間皮瘤中Syndecan－4表達增加并可能與腫瘤細胞的增殖相關。與正常組織相比，Lewis肺癌細胞和間皮瘤細胞中Syndecan－2表達上調，其在結腸癌細胞中的表達可達到正常水平2～5倍，并為細胞周期過程和細胞外基質之間的相互作用所必需［13］。

酵母雙雜交實驗中采用Syndecans胞漿結構域作為誘餌首次發現 mda－9／Syntenin是Syndecan的結合蛋白。Syndecans家族4個蛋白質的近膜面以及小的胞漿結構域在結構上極其相似并在進化上高度保守，提示這一部分對于Syndecan功能的發揮至關重要。mda－9／Syntenin缺失突變體分析顯示，mda－9／Syntenin通過FYA－C末端氨基酸序列與Syndecans相互作用，但需要mda－9／Syntenin的兩個PDZ結構域同時存在；而mda－9／Syntenin的N末端于其功能的發揮無關緊要。mda－9／Syntenin與Syndecans在細胞膜和細胞內囊泡上共同表達。進一步研究顯示，mda－9／Syntenin的PDZ結構域與PIP2的相互作用控制著Syndecan從內涵體腔返回細胞膜的循環過程。mda－9／Syntenin的兩個PDZ結構域均可與syndecan或者PIP2相互作用，其中PIP2對PDZ1的親和性高于PDZ2。細胞膜中高水平的PIP2可以完全取代Syndecans，使其離開mda－9／Syntenin并返回到細胞表面。缺乏與PDZ相互作用的Syndecan不能通過這一通路進行循環而被包裹在胞漿的內涵體或者核周區室內，并由內質網系統快速降解。與此同時，大量結合到Syndecans硫酸肝素鏈上的黏附分子和信號蛋白（FGF受體和整合素）也被包裹到這些內涵體中，使得細胞表面的受體數量失衡最終導致細胞擴散、黏附及運動功能受到抑制。

mda－9／Syntenin與 NF2／schwannomin／merlin NF2 基 因的失活突變體可導致神經鞘瘤、腦膜瘤，室管膜瘤和其他中樞神經系統腫瘤的發生；NF2基因的產物稱為NF2蛋白、schwannomin－1（sch－1）或者 merlin，該蛋白的失活可導致甲狀腺癌、肝細胞癌、神經束膜瘤腫瘤的發生［14］。

NF2在胞膜相關蛋白和細胞骨架之間提供調節性的連接，作為一種新的抑癌基因通過調節細胞外信號與細胞骨架之間的連接而在細胞生長和黏附過程中發揮關鍵作用。依據羧基端16個氨基酸的不同可將NF2蛋白分為2種亞型，即sch－1和sch－2。只有sch－1過表達時具有抑制生長的能力，提示其羧基端16個氨基酸在調節抑癌功能方面具有重要作用。sch－1在C末端的25個氨基酸可與mda－9／Syntenin的兩個PDZ結構域共同調節二者的結合；sch－1的VAFFEEL區域突變分析確定了這一序列對于mda－9／Syntenin的識別至關重要。在體內和離體情況下，兩種蛋白相互作用并共表達于細胞膜內面和斑點狀細胞囊泡中。表達反義mda－9／Syntenin的成纖維細胞出現了sch－1亞細胞定位的改變，提示Syntenin／sch－1相互作用在將sch－1運輸并錨定在細胞膜過程中具有重要作用。

Syntenin與其他蛋白的相互作用 mda－9／Syntenin還分別與白細胞介素－5（IL－5）受體以及轉錄因子Sox4，ephrin B1，谷氨酸受體以及Unc51.1和Rab5相互作用，從而B細胞發育和分化的調節、控制軸突延伸方向、調節神經遞質傳遞等多種生物過程中發揮重要作用。而且有最近研究表明mda－9／Syntenin通過與泛素相互作用在調控腫瘤轉移和侵襲中起著重要的作用［15］。

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