Caspase-3與腦缺血再灌注后細胞凋亡相關性研究進展*

張 霞，高維娟

(1.承德醫學院病理生理學教研室，河北承德 067000;2.河北化工醫藥職業技術學院)

綜述講座

Caspase-3與腦缺血再灌注后細胞凋亡相關性研究進展*

張 霞1，高維娟2△

(1.承德醫學院病理生理學教研室，河北承德 067000;2.河北化工醫藥職業技術學院)

半胱氨酸蛋白酶-3;腦缺血再灌注;細胞凋亡

缺血性腦血管病是目前神經內科最常見的一種疾病，其致殘率非常高。治療一般是以疏通堵塞的血管、改善病變部位的血液供應為主，但當缺血部位的血液供應好轉以后就容易發生更加嚴重的再灌注損傷[1]。腦缺血再灌注損傷是腦缺血后腦組織恢復血流灌注時引起腦細胞更嚴重損傷的一種病理生理現象。研究表明，腦組織缺血早期，缺血區以神經細胞壞死為主，而后期缺血半暗帶發生的遲發性神經細胞死亡則以細胞凋亡為主[2]。細胞凋亡(apoptosis)是個不同于細胞壞死的新概念，并使人們對疾病的發生、發展和轉歸有了一個全新的認識。細胞凋亡是由體內外各種因素觸發細胞內預存的死亡程序而導致的細胞死亡過程，是一個在基因調控下的嚴密、完整的程序化過程，以細胞核濃縮、染色體DNA被以核小體為單位切成梯狀片段、細胞縮小、最終形成凋亡小體(apoptosis body)等形態變化為特征[3]。細胞凋亡的誘導及調控過程十分復雜，涉及一系列相關分子及信號轉導通路，目前尚處于揭示階段。現就Caspase-3介導的細胞凋亡途徑在腦缺血再灌注損傷中的作用做一綜述。

1 Caspase-3酶原及活酶的結構

Caspase家族是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，是目前已知的凋亡最后執行因子。凋亡的最后實施是通過Caspases的激活而實現的，而Caspase-3為該級聯反應的下游關鍵因子，在各種啟動的凋亡程序中起最后樞紐的作用[4]。

Caspase-3又稱為半胱氨酸蛋白酶32(cysteine protease P32,CPP32)，或稱Yama、apopain等，是1994年被發現的一個促凋亡調節基因，相對分子質量為32kD[5]，在人類基因中定位于4q32-4q35.1處，其由3個區域構成:氨基端的原域(prodomain)、大亞單位和小亞單位。正常情況下，Caspase-3在細胞質中以無活性的酶原形式存在，其激活過程是一個產生p20/p10二聚體的蛋白水解事件。Caspase-3酶原在活化過程中從p28-Ser29和Asp175-Ser176二處被剪切，并形成P20和P12兩個片段，兩種亞基借P12再連接成具有活性的Caspase-3異二聚體。活化的Caspase-3的三維結構為兩個異二聚體(大亞單位和小亞單位)以相對的方式形成一個四聚體，兩個小亞單位在中間，大亞單位在外周。每個異二聚體包含一個活性位點，由大小亞單位的氮基酸殘基共同組成，它們對結合和催化底物來說都是必需的[6]。兩個亞單位組成的異二聚體，是細胞凋亡早期階段激活的關鍵蛋白酶，是細胞凋亡的執行者，可以導致細胞結構的全面解體。

2 Caspase-3酶原的激活

Caspase-3酶原能被Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12及顆粒酶B等所激活。最近的研究表明，缺血-再灌流后細胞內大量自由基產生，導致細胞膜受損，同時線粒體及內質網等細胞器也損傷，進而能從不同的途徑激活Caspase-3，導致細胞凋亡。目前認為，Caspases-3激活途徑主要有三條[7]:線粒體/細胞色素C通路、死亡受體通路和內質網通路。腦缺血再灌注后，可以通過其中的一個或多個通路轉導凋亡信號，進而激活Caspase-3，誘導細胞凋亡。

2.1 線粒體途徑活化Caspase-3 細胞凋亡的線粒體通路:當細胞出現ATP耗竭，細胞內Ca2+超載，自由基增多，受體介導的死亡信號激活(Fas和TNF-R)及促凋亡和抗凋亡的Bc1-2家族蛋白的表達發生變化時，均可引起線粒體膜孔開放，導致線粒體通透性改變。線粒體通透性改變的結果是線粒體腫脹，內膜極化，氧化磷酸化脫耦連，以及內膜蛋白(細胞色素-c，凋亡誘導因子AIF)釋放。AIF可活化效應性凋亡蛋白酶，進而激活線粒體釋放細胞色素-c(Cyt-C)大量進入胞漿，在dATP/ATP存在的條件下，與凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)結合，形成cyt-c-Apaf-1復合物，此復合體通過Apaf-1氨基端的CARD與Caspase-9原域的CARD之間的蛋白相互作用，以1:1比例募集胞質中的Caspase-9，Caspase-9酶原之間因相互靠近，自我剪切而活化[8]。活化的Caspase-9進而激活Caspase-3，導致細胞凋亡。

2.2 細胞膜途徑激活Caspase-3 細胞凋亡的死亡受體通路:死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體基因超家族成員，可傳導由特定的死亡配體引起的凋亡信號。目前的研究發現，至少有5種死亡受體在細胞凋亡信號傳導中起作用，最典型的是Fas。一旦細胞受到某些凋亡信號的刺激， Fas分子可與其特異性配體Fas-L結合。Fas-L以同源三聚體復合物形式存在, 每一個Fas-L三聚體可結合三個Fas分子，導致三個Fas分子內的DD(Death domain)相互串聯。串聯的Fas的DD可以與FADD(Fasassociated death domain)的DD結合，這種結合又導致FADD的DED(Death effectdomain)與Caspase-8酶原的DED類似區域結合，從而激活Caspase-8，Caspase-8進一步激活下游的Caspase-3，最終導致細胞凋亡[9]。

2.3 內質網應激誘導Caspase-3表達 細胞缺血缺氧、葡萄糖/營養物質缺乏、ATP耗竭、大量自由基的產生、鈣超載、蛋白降解減弱等均可引起內質網(endoplasmic reticulum，ER)功能障礙，從而觸發內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。過度ERS通過PERK(PERK為I型內質網跨膜蛋白，屬于elf2a蛋白激酶家族成員)活化、elf2a磷酸化等途徑誘導Caspase-12、CHOP(C/EBP homology protein是 一個b-zip轉錄因子，屬于CCAATP增強子相連蛋白的轉錄因子C/EBP家族，又稱作GADDl53)等活化，促進細胞凋亡。CHOP通過下調Bcl-2表達，耗竭谷胱甘肽，促進反應性氧族產生等，進而活化Caspase-3，導致細胞凋亡[10]。活性Caspase-12需則與另外內質網應激分子協同使Caspase-9激活，活化的Caspase-9裂解Caspase-3酶原等效應Caspase，效應Caspase切割多ADP-聚合酶(PARP)和多種其它細胞內的底物，最終導致細胞凋亡，屬于非Cyt-c依賴的特異級聯反應[11]。

3 Caspase-3與腦缺血再灌注后細胞凋亡

3.1 Caspase-3可促進腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡腦缺血/再灌注損傷是一種常見的、復雜的病理生理過程[12]。Tominaga等[13]首次證實缺血性腦損傷可引起神經細胞凋亡。近年來，許多學者也從形態學、分子生物學等方面研究證實，細胞凋亡參與了腦缺血再灌注損傷。有研究表明[14]，腦缺血后隨著再灌注時間的延長，缺血側皮層凋亡細胞數量明顯增加，主要分布在梗死灶邊緣區，48h凋亡細胞達到高峰，說明凋亡在腦缺血/再灌注損傷中起重要作用。Caspase-3也參與了腦缺血后神經元損傷的病理過程，并在腦缺血再灌注損傷中起重要的作用[15]。近來還認為Caspase-3的激活是參與腦缺血后神經元凋亡的關鍵步驟, Caspase-3是最終執行者[16],在腦缺血損傷中起重要作用。動物實驗[17]顯示,在成年正常大鼠腦組織中,Caspase-3表達水平較低。腦缺血后,缺血半暗帶區的Caspase-3表達明顯增加，并在24h達到高峰[18]。趙敏等研究證實[19]，大鼠局灶性腦缺血及再灌注早期，Caspase-3表達變化不明顯，再灌注6h-48h逐漸增高，在48h達到高峰，與神經元凋亡DNA裂解率表達時間分布一致，幾乎是在相同的時間，同樣提示Caspase-3參與了缺血后細胞凋亡過程。應用Caspase-3抑制劑可使缺血神經元的損傷明顯減輕，也支持腦細胞缺血死亡涉及Caspase-3的觀點[20]。Le研究也表明，和正常大鼠相比，Caspase-3基因敲除的大鼠腦缺血2h再灌注48h后，皮層的梗死體積降低了55%，TUNEL陽性細胞密度下降了36%，說明Caspase-3在腦缺血再灌注細胞損傷中發揮了重要作用[21]。另有文獻報道，在缺血缺氧性腦損傷及腦缺血再灌注損傷中，應用Caspase-3抑制劑可有效地減少腦缺血后神經元凋亡的數量，從而起到腦保護作用[22]。以上的研究結果說明，Caspase-3參與了缺血性腦損傷，并在缺血神經元的凋亡過程中發揮重要作用。

3.2 Caspase-3在腦缺血再灌注后細胞凋亡中的作用機制 Namura[23]在小鼠MCAO模型中觀察到再灌流后不僅Caspase-3mRNA表達增加，而且Caspase-3裂解物免疫反應也增強。活化后的Caspase-3可以切割許多蛋白質底物, 所作用的底物多為維持細胞生命活動的重要功能蛋白，它們分別參與細胞骨架重建、DNA修復和mRNA裂解。多種多樣的刺激因素均可以激活Caspase-3，引起多效基因變化，使胞質、胞核及細胞骨架的重要蛋白質降解失活[24,25],從而導致細胞不可逆性地走向凋亡。

目前所發現的Caspases的底物一共有40種，其中大都可為Caspase-3所降解。Caspase-3可以水解結構蛋白(A-spectrin、B-spectrin、tau蛋白等)、看家蛋白(actin、fodrin、keratin)等，使細胞骨架結構破壞，核蛋白瓦解，染色體濃縮。Caspase-3也可以水解脫氧核糖核酸酶(CAD)的抑制蛋白ICAD，使CAD 活化進入細胞核發揮核酸酶功能，使 DNA斷裂進而降解染色體，直接導致細胞凋亡。Caspase-3還可以裂解抗凋亡蛋白Bcl-2，使其失去活性，發揮促進凋亡的作用。同時，Cheng等[26]研究證實，當Bcl-2蛋白被Caspase-3直接剪切，剪切后形成的片段可以進一步促進下游Caspase-3激活和放大Caspases級聯反應，這樣就形成了一個Caspases級聯反應的正反饋環路，證明了其裂解產物也可以促進凋亡。Caspase-3 還能水解并滅活DNAPKcs、PARPD 等DNA 修復酶，阻斷DNA的復制與修復，干擾剪切，破壞DNA結 構。Caspase-3還 能 識 別PARP(poly ADP-ribose polymerase)中 的Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)序列，從而切割PARP，被切割的PARP激活受PARP負調控的核酸內切酶的活性，最終使核小體間的DNA 降解，出現形態學上的DNA梯帶。Nicholson等[27]報道，活性Caspase-3能夠在哺乳動物細胞中剪切多聚ADP-核糖多聚酶導致細胞凋亡。Endres等[28]同樣證實了活性Caspase-3的這一重要效應。有研究報道,Caspase-3還能誘導細胞表達吞噬信號，使細胞水解為凋亡小體被吞噬細胞吞噬消除，產生凋亡的不可逆效應。

4 結語

腦缺血再灌注后細胞凋亡的發生是一個復雜的過程，諸多研究顯示其發生是多因素協同作用的結果，可通過各種途徑激活Caspase-3，使細胞發生凋亡。了解Caspase-3在不同條件下的表達情況，可選擇合適的時間窗有針對性地選用Caspase-3抑制劑，盡量減少腦缺血再灌注后神經元的凋亡，對于阻止腦神經功能的進一步惡化、改善腦神經功能具有重要意義。

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Q255

A

1004-6879(2013)01-0055-04

2012-10-11)

*國家自然科學基金項目(81072923)

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