驅動蛋白Eg5抑制劑在腫瘤研究中的進展＊

羅興燕，張 梅，劉 進綜述，舒 茂△審校（.重慶理工大學藥學與生物工程學院 400054；.重慶醫藥工業研究院有限責任公司 400600）

有絲分裂雙極紡錘體是癌癥化學療法中一個已證實的藥物靶點，如紫杉烷和長春堿等作用于微管抑制紡錘體形成，在臨床上是一類很成功的抗腫瘤藥物。但微管在細胞的高爾基體、突觸小泡等細胞器的轉運具有重要作用，對軸突微管也有抑制影響。因此，作用于微管的抗增殖藥物具有不可逆轉的神經毒性，長期使用這類藥物會使腫瘤產生抗藥性［1］。尋找有絲分裂紡錘體的其他靶點是目前開發新的抗腫瘤藥物的重要途徑。紡錘體驅動蛋白家族是紡錘體形成的重要蛋白，已成為近年來靶向抗癌化學療法的新靶點［2］。驅動蛋白在有絲分裂的紡錘體形成、細胞分裂和增殖中發揮關鍵作用。驅動蛋白家族有650個成員，被分為14類亞家族，主要有細胞分離和蛋白轉運兩大類主要功能。Eg5是紡錘體形成中的重要蛋白，在不發生細胞分裂的細胞中沒有表達。因此，Eg5抑制劑在神經細胞中沒有毒性作用，不具有抗微管藥物的作用［3］。近年來已經成為抗癌藥物的研究熱點，本文就Eg5參與腫瘤的機制及其抑制劑研究現狀綜述如下。

1 Eg5結構和功能

Eg5也稱KIF11，是驅動蛋白家族5中BimC的同源四聚物，屬于N型驅動蛋白。Eg5共有1 057個氨基酸殘基，主要有3個結構域：N端的啟動區、卷曲螺旋結構的莖干區和C端尾巴區。啟動區前有20個氨基酸殘基，開始于β1折疊結構的Val21，終止于 RAK 模序 R6結構上的 Lys357。Asn358－Pro363是連接啟動區和中間卷曲結構（Glu364－Val523，Cys684－Lys716，Gln782－Arg826）的連接子（linker）。Eg5的 C末端區域（Tyr829－Leu1057）包含一個p34cd2磷酸化位點，在體內Thr927是p34cd2蛋白激酶一個主要的磷酸化位點［4］。Eg5的二級結構主要由β片層和α螺旋結構組成［5］。

Eg5四聚體形成兩兩二聚體相互交叉，棒狀末端反向平行在微管上滑動產生外向的力。N－末端驅動蛋白沿著微管（MTs）滑動，主要功能是在中心體分離組裝形成雙極紡錘體時，提供一個正向牽力，并防止雙極性紡錘體在染色體分離后期之前崩解［6］。因此，Eg5常被人熟知的功能就是形成紡錘體，參與有絲分裂。研究者通過RNAi干擾技術、Eg5抗體中和及小分子抑制劑抑制Eg5均可以阻滯腫瘤細胞在有絲分裂中期，隨后導致細胞死亡［2］。Bartoli等［7］最近研究提出Eg5同時可以參與多肽的合成，其小分子抑制劑可能會影響細胞有絲分裂間期的蛋白合成［8］。但是目前主流的觀點還是集中在Eg5對細胞有絲分裂中期的影響，其中最具有意義的就是抑制劑和Eg5作用形成Monoastral紡錘體［9］。Monoastral紡錘體最初是Mayer等學者在1999年發現化合物Monastrol與Eg5形成復合物導致有絲分裂中止，紡錘體中止在有絲分裂中期的特征結構定義。Monastrol是第一個發現的Eg5蛋白特異性小分子化合物抑制劑，主要是與Eg5結合后通過構象改變抑制二磷酸腺苷（ADP）從Eg5中的釋放，是一類三磷酸腺苷（ATP）的非競爭性抑制劑［10］。Kaan等學者用Eg5與S－三苯甲基－L半胱氨酸（S－trityl－L－cysteine，STLC）結合的晶體復合物0.2nm分辨力來研究抑制劑與Eg5結合方式，抑制劑與Eg5結合后使Eg5構象改變，導致ADP不能從Eg5中釋放形成 Monoastral紡錘體［5］。

Eg5與有絲分裂密切相關，有研究證明了Eg5在腫瘤中表達失調，與腫瘤的發生、發展相關。Nowichi等［11］就利用基因芯片分析中發現Eg5在慢性粒細胞性白血病中高表達。南開大學的生命科學遺傳細胞實驗室發現在胰腺癌細胞中Eg5也高表達，導致細胞快速增殖［12］。這些研究都為Eg5可以作為一個潛在的抗腫瘤藥物靶點提供了依據，使Eg5的抑制劑開發成為了近年來的熱門研究。

2 Eg5抑制劑

隨著Monastrol的發現和報道，尋找Eg5新的抑制劑成為許多醫藥公司和研究者研究開發抗腫瘤藥物的熱點，Eg5抑制劑篩選多是基于化合物的高通量篩選和已知化合物的結構改造，結合多學科的發展如計算機、生物信息學、生物化學、醫學等來完成，抑制劑的種類和數量不斷地被研究擴展。如2004年發表的STLC化合物，其發現過程是Debonis從NCI數據庫最開始篩選到2 869個小分子化合物用于測試他們抑制微管－Eg5中的ATP酶活性，結果有154個化合物具有抑制Eg5的ATP酶活性，154中有15個化合物的孔雀綠測試中抑制結果為陽性，其中，5個化合物抑制HeLa細胞，使有絲分裂中止。STLC是其中活性最好，能抑制Eg5能使紡錘體形成Monoastrol紡錘體［13］。STLC發現后，Debonis又利用計算機藥物設計軟件和化學合成對STLC結構優化得到了一系列活性更好的化合物，STLC的抗癌活性在膀胱癌，前列腺癌等體外實驗研究中得到了驗證［3，14］。

參與Eg5抑制劑的研究中包含了一些大型的醫藥公司和研究單位，由于這些科研工作者的不斷努力，近10多年的時間越來越多的Eg5抑制劑和研究方法被研究報道，其中，活性好的化合物已 經進入了臨 床研究［13，15－19］，如Ispinesib、AZD4877化合物已經進入Ⅰ／Ⅱ期臨床研究。

2.1 Ispinesib／SB－715992 Ispinesib／SB－715992是屬于嘧啶酮類化合物由GlaxoSmithKline和Cytokinetics公司開發，Ispinesib的作用機制與Monastrol抑制方式相同，均通過結合Eg5形成Monoastral紡錘體，中止細胞有絲分裂，但比Monastrol具有更好的活性，是第一個進入腫瘤臨床試驗的驅動蛋白Eg5ATP酶的變構的小分子抑制劑［20］。在臨床前研究中，Ispinesib抑制人類和小鼠細胞系的IC50為1.2～9.5μM，在體外用20μM的Ispinesib作用于SKOV3卵巢癌細胞可導致有絲分裂中止。對裸鼠移植瘤模型，如結腸癌、非小細胞肺癌、胰腺癌，腹腔注射Ispinesib 30mg／kg，均發現腫瘤的生長延遲。2003年Glaxo Smith Kline公司進入非小細胞肺癌Ⅱ期臨床研究，至今Ispinesib有16個項目進入了臨床Ⅰ／Ⅱ研究，隨后多個研究機構進行多種腫瘤的臨床研究，所有的研究中沒有明顯的藥物毒性產生，劑量限制性毒性（DLT）表現為中性粒細胞減少，沒有觀察到明顯的神經毒性［21－22］。但是在惡性黑色素瘤、頭頸部腫瘤、前列腺癌、肝癌Ⅱ期臨床研究中作用效果不好，可能原因是由于在動物移植瘤中瘤細胞分裂占大部分而人腫瘤分裂相對少，藥物的半衰期短，作用于靶點位置的時間不夠，造成在人的腫瘤中效果不佳［23］。臨床研究中的14個項目已經完成，其中，2個還在繼續研究。

2.2 AZD4877 AZD4877由Astra Zeneca研究開發，也屬于嘧啶酮類化合物。AZD4877是從一系列新穎的驅動蛋白紡錘體蛋白（KSP）抑制劑篩選出的抑制Eg5活性的化合物，兼具優異的生化性質和藥物特性的適合于臨床開發的Eg5－ATP酶的變構的小分子抑制劑［24］。AZD4877研究對很多來源于實體瘤和血液瘤的細胞株都有抑制作用［16］。裸鼠移植瘤模型的原發性膀胱腫瘤模型、利妥昔單抗不敏感非霍奇金淋巴瘤模型（DoHH2T53）中，在 AZD4877劑量的耐受范圍，25mg／kg可以檢測到Monoastral紡錘體，這些均為AZD4877臨床研究提供了依據。AZD4877在西方和日本實體瘤患者的Ⅰ期臨床研究都有很好的耐受性和安全性，但是并沒有觀察到高的抗癌活性［17］。目前進入臨床的6個項目都因為AZD4877在Ⅱ期臨床研究中沒有作用而中止研究［16－17，25］。

2.3 SB－743921／ARRY－520 嘧 啶酮 類 化 合物Ispinesib和AZD4877在多種腫瘤Ⅱ期臨床研究結果顯示效果不好，抗腫瘤活性不高。第二代嘧啶酮類化合物SB－743921與前2種化合物相比，它的臨床前研究結果顯示活性更好，在Holen報道的SB－743921的藥代動力學和生物學效應得到令人滿意結果，推薦Ⅱ期臨床研究的劑量為4mg／m2，每天靜脈滴注1h并持續21d。以Ispinesib結構改造的Eg5抑制劑還有ARRY－520等多個嘧啶酮類化合物衍生物，也進入了臨床研究，目前，還沒有臨床數據報道，他們的活性比Ispinesib更高［26］。

2.4 MK－0731 二氫吡唑類、二氫吡咯類化合物是 Merck公司研究實驗進行高通量篩選和結構改造合成的一批具有良好活性的Eg5抑制性的化合物，其作用機制與Monostral一樣，與Eg5結合后通過構象改變抑制ADP從Eg5中的釋放，也屬于一類ATP的非競爭性抑制劑［27］。其中，化合物 MK－0731是優化改造后具有良好的化學特性和生物特性，在體內外表現出低毒性和好的藥代動力學性質?；衔锬芤种茖ψ仙即妓幬镆蕾嚨哪[瘤生長。臨床前實驗研究表現出良好的最大劑量耐受，不良反應小，安全性好，MK－0731在實體瘤的Ⅰ期臨床實驗中沒有觀察到明顯的腫瘤減?。?8］。

雖然Eg5抑制劑在臨床前研究結果取得好的進展，但是在臨床中的研究的結果大多數都是不盡人意，進入人體的安全性好但是基本也沒有活性。通過上面幾種化合物的分析研究，臨床前期在動物模型有藥物作用，但在臨床研究中患者的體內沒有作用，可能原因在動物模型中進行有絲分裂的腫瘤細胞的比例比腫瘤患者的腫瘤細胞比例高，抑制劑作用患者時間不足以造成腫瘤細胞有絲分裂中止，抑制劑作用的腫瘤細胞株不敏感等，造成在動物模型中的效果好。這也需要研究者的繼續研究來突破這些缺點。

3 Eg5研究趨勢

Monastrol是第一個被發現的Eg5驅動蛋白抑制劑，與Eg5結合形成Monoastral紡錘體后使有絲分裂中止造成細胞凋亡后死亡。Eg5在穩定的細胞中不表達，不對神經細胞造成毒性，克服了目前抗微管腫瘤藥物造成的不良反應和耐藥性。因此，Eg5成為了熱門研究靶點，國內外大型醫藥公司和頂尖實驗室都努力尋找最優的Eg5抑制劑并希望開發新一代抗癌藥物，用以克服現在抗微管藥物出現的不良反應，其中，一些化合物已進入了臨床試驗抗癌研究階段。至今有30多種化合物進入了臨床研究，但是沒有一種化合物成為藥物上市。這些化合物雖然不良反應小，但因在體內抗癌藥物活性不高而沒有繼續被研究。Eg5抑制劑開發面臨著幾個問題：Eg5抑制劑對什么類型腫瘤敏感？在體內如何提高藥物和腫瘤作用時間來中止有絲分裂？目前研究顯示，Eg5抑制劑單一療法效果不佳，聯合用藥雖然有研究報道，但沒有發現協同作用。

Eg5是一個很吸引人的藥物靶點，但其藥物抑制劑要用于抗癌藥物治療仍需要研究人員的不懈努力?，F階段亟待解決的主要問題是：Eg5的研究應走向何方；如何開發新的篩選方法尋找新的Eg5抑制劑；如何建立高通量篩選方法為抑制劑快速找到敏感的腫瘤株；如何同現有的腫瘤抑制劑聯合用藥，以發揮不同的藥物作用以及改變藥物的劑型以提高在體內的時間，在Eg5中尋找到新的抑制方式，發現新的抑制劑。還有，Eg5屬于驅動蛋白的一個大家族，找尋其他的驅動蛋白靶標也成為現在抗腫瘤藥物發展的新方向。

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