CD31在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義

趙長祺，尹長江

(承德醫學院，河北承德 067000)

甲狀腺癌是頭頸部比較常見的惡性腫瘤之一，其中，約半數以上患者為甲狀腺乳頭狀癌(Papillary Thyroid Carcinoma,PTC)[1]。國內外研究顯示，甲狀腺癌是多種因素共同作用的結果，其發生的具體機制較為復雜，目前還尚未完全揭示。CD31，即血小板內皮細胞粘附分子(plateletendothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1),是內皮細胞的標志物，在淋巴管和血管內皮細胞中均有表達。現有研究表明，CD31與甲狀腺癌組織的轉移有著密切的關系[2]。本試驗采用免疫組化和Western-Blot法檢測CD31在甲狀腺乳頭狀癌組織和正常組織中的表達，探討CD31在甲狀腺乳頭狀癌臨床治療上的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標本 分別收集承德醫學院附屬醫院2009年9月至2010年8月的甲狀腺乳頭狀癌臨床標本60例，癌周組織20例，年齡45-65歲，其中男性患者21例，女性患者39例，經病理檢查證實均為原發性甲狀腺乳頭狀癌。取臨床病理標本經10%中性甲醛固定，常規脫水透明、浸蠟、包埋，連續切片，切片厚5μm，用于CD31免疫組織化學染色。取臨床病理標本新鮮組織凍存于液氮中，用于蛋白免疫印跡檢測。

1.2 主要試劑 兔抗CD31多克隆抗體(美國Sigma公司);羊抗兔IgG二抗(美國Rockland公司);免疫組化試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.3 CD31蛋白免疫組化檢測 采用免疫組化法檢測甲狀腺乳頭狀癌及癌周組織中CD31的表達情況。取臨床標本石蠟切片梯度脫蠟水化后，以3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后進行微波抗原修復，山羊血清封閉20min后，依次經兔抗CD31多克隆抗體4℃孵育過夜，羊抗兔IgG 37℃孵育30min，SABC 37℃孵育20min，然后加入二氨基聯苯胺(DAB)避光顯色5min，最后經蘇木素復染、乙醇梯度脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。通過光學顯微鏡進行觀察、拍照，血管內皮細胞胞質內呈棕黃色或棕褐色染色者為CD31陽性，不著色者為陰性。

1.4 CD31蛋白印記雜交檢測 提取甲狀腺乳頭狀癌及癌周組織總蛋白進行蛋白濃度定量，一抗選用兔抗CD31多克隆抗體，二抗選用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，以β-actin作為內參，應用Western-Blot法檢測甲狀腺癌及癌周組織CD31蛋白的表達水平。蛋白上樣量為40μg，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，一抗振蕩孵育2h(一抗終濃度2μg/ml)，二抗溫和振蕩孵育1h，洗膜后采用化學發光法顯影，暗室X光膠片曝光，采用Quantity One-v4.6.2軟件對顯影條帶進行分析，并計算各待測條帶與其相應內參β-actin的灰度值比值，確定CD31蛋白的相對表達水平。

1.5 統計學處理 采用SPSS13.0統計分析程序對試驗結果進行統計學處理，組間差異顯著性用方差分析法檢驗，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，數據以均數±標準差(±s)表示，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CD31在甲狀腺癌組織中的表達 微血管處可見棕黃色的細顆粒狀染色，為CD31陽性反應，其主要表達于甲狀腺癌周間質血管的內皮細胞中。CD31在甲狀腺癌組織中的陽性表達率為67.69±10.97%，明顯高于癌周組織的22.87±5.16%，兩者之間的差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 甲狀腺乳頭狀癌組織中CD31的相關性 對甲狀腺乳頭狀癌及癌周組織CD31蛋白的Western-Blot檢測結果顯示，CD31蛋白分子量約為130kD，與癌周組織相比，甲狀腺乳頭狀癌組織中CD31蛋白的表達明顯升高。以各待測條帶與其相應內參β-actin的灰度值比值做統計分析，結果表明，與癌周組織(0.26±0.03)相比，甲狀腺癌組織中CD31蛋白的相對表達(0.62±0.09)顯著上調。

3 討論

CD31是一種內皮細胞連接分子，參與人體內多種生理過程，其主要在血管內皮細胞中表達，拷貝數可達到106拷貝/細胞，是內皮細胞的重要標記物[3]。現有的研究表明CD31參與了血管生成，在炎癥反應、創傷愈合、腫瘤發生發展等過程中均具有著重要的意義[4]。因此，作為血管內皮細胞的重要標記物，CD31在甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展過程中直接反映了甲狀腺乳頭狀癌微血管的生成情況。本研究的統計學結果顯示，CD31在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達明顯升高，提示其可能在甲狀腺癌腫瘤微血管形成過程中起到一定的促進作用，腫瘤內血管生成增多，可增加腫瘤細胞向遠處轉移的機會。因此，本研究結果提示，CD31可能在甲狀腺乳頭狀癌的轉移過程中發揮著重要作用。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌的發展及轉移與CD31的表達密切相關，CD31的表達越高，腫瘤的轉移性越強，預后越差，所以，CD31可作為甲狀腺乳頭狀癌腫瘤轉移和病情進展的重要信號。研究結果顯示，甲狀腺乳頭狀癌中CD31表達水平有望成為判斷臨床療效和預后的重要指標之一。

[1]徐銀峰,丁國芳,孫瑜,等.前列腺癌VEGFR-3和CD3表達與腫瘤轉移的研究[J].浙江中醫學院學報,2005,29(5):14-17.

[2]Hasan J,Byers R,Jayson GC.Intra-tumoural microvessel densit in human solid tumours[J].Br J Cancer,2002,86(10):1566-1577.

[3]Jacquemier J,Mathoulin-Portier MP,Valtola R,et al.Pro gnosis of breast carcinoma lymphangio-genesis evaluated b immunohistochemicnal investigation of vascular-endothelial growth- factor receptor 3[J].Int J Cancer,2000,89(1):69-73.

[4]Elaine S,Marcos RT,Alexandre MA,et al.Anglogenesis a indicator of metastatic potential in papillary thyroid carcinoma[J]Clinics,2005, 60(3):233-240.