大鼠大腦皮層星形膠質細胞體外培養方法的建立及鑒定*

范 悅，商亞珍

(河北省中藥研究與開發重點實驗室/承德醫學院中藥研究所，河北承德 067000)

神經膠質細胞是神經組織中除神經元以外的另一大類細胞，廣泛分布于中樞神經系統和周圍神經系統。中樞神經系統膠質細胞有星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞，其中星形膠質細胞數量最多，幾乎囊括了所有膠質細胞的功能。星形膠質細胞與神經元之間存在復雜的相互作用，以維持神經系統內環境的穩定，對神經元的生存、正常中樞神經系統生理發育及病理過程都具有重要作用[1-2]。本研究探討了如何建立實驗室內可行的獲得高純度星形膠質細胞的體外培養方法，以期為星形膠質細胞的生物學研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM-F12培養基，美國GIBCO公司;胎牛血清，奧地利PAA公司;胰蛋白酶，華美生物工程有限公司;纖維酸性蛋白(GFAP)一抗，北京中杉金橋生物技術有限公司;羊抗兔二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 星形膠質細胞原代培養 新生1-3d的SD大鼠，雌雄不限。剪開皮膚和顱骨，取兩塊皮質，預冷PBS漂洗1-2次后，仔細剝除腦膜和血管。剪碎，加入0.125%胰蛋白酶置于37℃培養箱中消化30min,消化完全后加入含20%胎牛血清的培養液終止消化。3500r/min離心5min，棄上清，計數，以2×105個/ml的密度接種于用0.1%多聚賴氨酸鋪底的培養瓶中。30min后輕輕翻轉培養瓶，吸出未貼壁的細胞懸液，重新接種于多聚賴氨酸包被的培養瓶中，差速貼壁以除去成纖維細胞。37℃、5% CO2培養箱培養，每3d換液一次。

1.3 星形膠質細胞傳代培養 培養至10-12d，待細胞80-90%融合時傳代。加入適量0.1%胰蛋白酶(以剛剛覆蓋細胞層為宜)后立即于倒置顯微鏡下觀察，待大部分細胞突起縮回、變圓時，立即吸出培養液，加入少量含10%胎牛血清的培養液直接吹打，待細胞層脫落。計數，以密度2×105個/ml接種于0.1%多聚賴氨酸包被的培養瓶中，當7-8d細胞80-90%融合時，再次傳代。

1.4 星形膠質細胞的鑒定 培養第3代的細胞以5×104個/孔的密度接種于24孔板內事先用0.1%多聚賴氨酸包被的圓形蓋玻片上，培養48h后進行免疫組化染色。吸去24孔板中的細胞培養液，加入PBS漂洗2-3次，加入4%多聚甲醛固定細胞30min后行免疫組化染色，一抗稀釋度1:100，陰性對照用PBS代替一抗，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，GFAP陽性產物位于細胞漿。

2 結果

2.1 細胞培養結果 剛接種的細胞為圓形，胞體較小，3-6h貼壁。3-4d可見細胞基本呈圓形，長出細小突起。5-7d細胞突起變長，呈梭形、多邊形等形狀。隨培養時間的延長，細胞數量增多，胞體變大，逐漸交織成網狀。傳代后細胞生長明顯加快，3-4h貼壁，2-3d呈多種形態，6-7d細胞80-90%融合。在培養過程中可偶見神經元，但隨培養時間的延長和傳代逐漸消失。

2.2 免疫組化結果 GFAP陽性產物位于細胞漿，呈棕黃色顆粒狀。細胞分兩層，上層為纖維性星形膠質細胞，胞核小，突起長而細;下層為原漿性星形膠質細胞，胞核大，橢圓，形狀不規則。隨機選取若干視野，計數陽性細胞數，顯示細胞純度95%以上。

3 討論

星形膠質細胞是中樞神經系統的主要間質細胞，構成神經組織網架，具有分裂能力，可分泌和釋放多種神經營養因子，能促進神經元生長，形成神經元微環境，具有神經營養功能[3]。

體外培養的膠質細胞，并非來自已經完全分化的星形膠質細胞和小膠質細胞，而是它們的前體細胞在體外培養系統中經發育、分化，最終成為成熟的膠質細胞。因此，取材時間最好在出生后的早期，此時前體細胞的數量接近峰值[4]。另外，使用新生1-3d大鼠的原因是出生后神經元不再分裂，可盡量減少神經元的污染，且神經元不能傳代，經過數次傳代即可去除神經元。而星形膠質細胞大量增殖發生在胚胎晚期和出生后，生長旺盛[5]。而且1-3d新生大鼠腦膜和血管較好剝離，盡量剝除腦膜和血管可以減少成纖維細胞的污染[6]。

本研究免疫組化結果顯示，培養的為混合星形膠質細胞，細胞分為上下兩層，纖維性星形膠質細胞和原漿性星形膠質細胞都屬于星形膠質細胞，可根據實驗需求不同，將兩種細胞分開培養[7]。原漿性星形膠質細胞多分布于腦和脊髓的灰質，含膠原纖維少，細胞體較大，突起寬而扁，分支少;纖維性星形膠質細胞多分布于腦和脊髓的白質，細胞內富含膠原纖維，突起細長，分支多[8]。

星形膠質細胞是神經膠質細胞中數量最多的一種除了以往認識的在神經系統中有營養支持作用外，與神經元之間還存在復雜的相互作用，也與許多神經退行性疾病密切相關，尤其是神經炎癥反應，由星形膠質細胞和小膠質細胞釋放的細胞因子介導。膠質細胞的異常改變直接影響神經功能的正常發揮[9-10]。因此，建立星形膠質細胞體外培養的方法有利于探討星形膠質細胞在神經退行性疾病中的角色，以及研究藥物的作用及機制。

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