基于雙向凝膠電泳-質(zhì)譜技術(shù)的小型豬心肌缺血氣虛血瘀證血漿特征蛋白質(zhì)研究1）

郭淑貞，啜文靜，付幫澤，王 勇，馮玄超，廉洪建，李長虹，鄭 磊，王 偉

證候是疾病特定階段的病生理特征的綜合反映。除了宏觀四診信息，證候在微觀生物學(xué)指標(biāo)層面必然也存在著特征性的變化。證候特征性生物學(xué)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，有利于提升臨床證候辨識的客觀性與準(zhǔn)確性。本文擬采用雙向電泳等蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段，探討冠心病（心肌缺血）氣虛血瘀證特征性的血漿蛋白質(zhì)譜，并分析其與證候表征的相關(guān)性，為后續(xù)的證候生物學(xué)標(biāo)志物的臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 對象 采用課題組前期建立的方法，制備小型豬心肌缺血氣虛血瘀證病證結(jié)合動物模型［1］。中華小型豬（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)小型豬養(yǎng)殖基地，體重25 kg±4 kg，月齡6～10個月）左冠脈前降支近端放置Ameroid縮窄環(huán)制備心肌缺血模型。在模型動物符合心肌缺血氣虛血瘀證診斷的窗口（術(shù)后8周），采集舌象、心功能等指標(biāo)并采集血漿樣本用于后續(xù)實驗。以同期的假手術(shù)動物作為對照。每組6只。

1.2 舌r、g、b分析 數(shù)碼相機拍照記錄動物舌象，以casmatch比色卡（BEAR Medic Corporation，日本）作為參照，采用photoshop軟件分析舌RGB值，并計算r、g、b。

1.3 左室射血分?jǐn)?shù)檢測 心動超聲（惠普Agilent SONOS 5500，美國）Simpson法檢測左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.4 血漿樣本收集和制備 動物頸部前腔靜脈采血3 m L，采用枸櫞酸鈉抗凝，并加入蛋白酶抑制劑（Roche），4℃，3 500轉(zhuǎn)／分，離心25 min，收集上清，分裝后-80℃保存。

1.5 雙向凝膠電泳 樣品冰上解凍后，4℃、12 000 g，離心5 min，取上清。Bradford法測定血漿蛋白質(zhì)含量后，取1.3 mg上樣，補加重脹液至450μL。平衡后的膠條轉(zhuǎn)入提前制好的厚度為1.0 mm、13%的SDS-PAGE膠中，采用ETTAN Dalt Six電泳系統(tǒng)進(jìn)行第二向分離。確定膠條與二相膠面接觸良好，0.5%瓊脂糖封膠。凝膠通過UMAX 2100XL掃描，膠圖數(shù)據(jù)存儲后，采用Imagemaster 2D Platinum 6.0軟件進(jìn)行凝膠的蛋白點檢測及匹配，配合三維圖像、Histogram及人工校對等方法，以實驗組與對照組的vol%的比值＞2或＜0.5作為可能的差異蛋白點，納入后續(xù)的分析。

1.6 差異蛋白斑點的鑒定 采用激光解吸附-時間飛行質(zhì)譜（Bruker Ultraflex質(zhì)譜儀，北京華大蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心檢測）進(jìn)行分析。質(zhì)譜獲得的單肽質(zhì)量通過檢索軟件Mascot在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，選擇種屬為豬。搜索得到的結(jié)果如果在綠色陰影區(qū)域以外則表示結(jié)果基本可信。

2 結(jié) 果

2.1 血漿樣本雙向凝膠電泳 蛋白點的總體分布顯示了高度的相似性，共813個匹配的蛋白點群被納入分析。vol%＜0.5的蛋白點表達(dá)下調(diào)，共確定了18種表達(dá)下調(diào)的差異蛋白點（見表1）。實驗組與對照組的vol%的比值＞2的蛋白點被認(rèn)為表達(dá)上調(diào)，共確定了6種（見表2）。

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果 由于豬的蛋白質(zhì)表達(dá)譜研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于小鼠等模式生物，只有2個蛋白得到了陽性檢索結(jié)果，分別為動力蛋白重鏈6（Spot11）和視黃醇結(jié)合蛋白4（Spot17）。詳見表3。

2.3 左室射血分?jǐn)?shù)、舌象rgb與差異蛋白表達(dá)豐度的相關(guān)性（見表4、表5）

表1 心肌缺血氣虛血瘀證表達(dá)下調(diào)的差異蛋白點（±s ）

表1 心肌缺血氣虛血瘀證表達(dá)下調(diào)的差異蛋白點（±s ）

編號 模型組 觀察組 模型組／對照組Spot1 0.150±0.107 0.955±0.409 0.157 Spot 2 0.011±0.004 0.055±0.021 0.205 Spot 3 0.140±0.037 0.523±0.125 0.267 Spot 4 0.011±0.002 0.035±0.008 0.304 Spot 5 0.012±0.008 0.039±0.013 0.308 Spot 6 0.124±0.036 0.337±0.081 0.367 Spot 7 0.006±0.004 0.015±0.013 0.368 Spot 8 0.194±0.005 0.483±0.387 0.401 Spot 9 0.882±0.009 2.141±0.997 0.412 Spot 10 0.211±0.018 0.509±0.133 0.414 Spot 11 0.010±0.001 0.024±0.010 0.419 Spot 12 0.142±0.019 0.321±0.046 0.443 Spot 13 0.188±0.109 0.414±0.212 0.453 Spot 14 0.703±0.340 1.540±0.906 0.456 Spot 15 0.453±0.158 0.958±0.554 0.473 Spot 16 0.476±0.110 0.995±0.260 0.478 Spot 17 0.021±0.005 0.043±0.012 0.481 Spot 18 0.026±0.008 0.052±0.024 0.488

表2 心肌缺血氣虛血瘀證表達(dá)上調(diào)的差異蛋白點（±s）

表2 心肌缺血氣虛血瘀證表達(dá)上調(diào)的差異蛋白點（±s）

編號 模型組 對照組 模型組／對照組Spot 19 0.215±0.074 0.102±0.053 2.103 Spot 20 4.390±3.309 2.079±1.159 2.112 Spot 21 0.031±0.008 0.014±0.009 2.124 Spot 22 0.198±0.040 0.093±0.008 2.125 Spot 23 0.069±0.048 0.025±0.002 2.767 Spot 24 3.826±1.757 1.338±0.965 2.860 Spot 25 0.455±0.044 0.154±0.173 2.952

表3 部分差異蛋白點的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

表4 LVEF、舌rgb與蛋白表達(dá)豐度的相關(guān)性

表5 LVEF、舌rgb與差異蛋白表達(dá)豐度的線性回歸分析

3 討 論

本研究采用雙向凝膠電泳的方法分析了心肌缺血氣虛血瘀證小型豬血漿蛋白質(zhì)表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了18個下調(diào)蛋白點和6個上調(diào)蛋白點。這些差異蛋白點均有可能成為心肌缺血氣虛血瘀證特征性的生物學(xué)標(biāo)志物，但必須通過多種檢測方法、大樣本的嚴(yán)格驗證與分析。鑒于蛋白質(zhì)組學(xué)屬于開放性研究系統(tǒng)，突破了既往從已知的疾病相關(guān)的文獻(xiàn)資料中篩選可能的證候生物學(xué)標(biāo)志物的局限，有可能發(fā)現(xiàn)新的、在相應(yīng)疾病的研究中尚無報道的證候特征性標(biāo)志物，這不僅有可能成為證候的診斷指征，而且有可能為證候的生物學(xué)基礎(chǔ)研究提示重要線索，還有望為疾病的發(fā)病機制闡明提示新的環(huán)節(jié)。質(zhì)譜鑒定結(jié)果提示，在心肌缺血氣虛血瘀證顯著下調(diào)的蛋白包括動力蛋白重鏈6和視黃醇結(jié)合蛋白4。

基因本體論分類中，動力蛋白最主要的生物進(jìn)程為ATP的分解代謝。動力蛋白在體內(nèi)的作用主要包括具有ATP酶活性，可作為呼吸道纖毛運動的動力來源、微管運動的動力來源，并參與了神經(jīng)細(xì)胞的體積、心臟鉀通道［2］等的調(diào)控。動力蛋白作為微管的重要組成部分還參與了心肌對機械刺激的反應(yīng)性調(diào)控［3］。

視黃醇結(jié)合蛋白4主要參與視黃醛的結(jié)合與轉(zhuǎn)運。在基因本體論分類中，視黃醇結(jié)合蛋白4的功能涉及多個生物學(xué)進(jìn)程，其中主要包括心肌組織發(fā)育、心肌細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等。既往的研究多顯示視黃醇結(jié)合蛋白4與脂代謝［4］、頸動脈粥樣硬化［5］、冠心病合并高胰島素血癥等相關(guān)［6］，血漿視黃醇結(jié)合蛋白4的水平在冠心病組并沒有升高［6］，而新近的女性人群研究則發(fā)現(xiàn)，全長的視黃醇結(jié)合蛋白4以及總視黃醇結(jié)合蛋白4呈時間依賴模式與冠心病的發(fā)病相關(guān)［7］。

目前的研究表明，動力蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白4均在能量代謝方面具有一定的作用，但并未見到上述蛋白與證候相關(guān)的研究報道。心肌缺血氣虛血瘀證動物外周血中動力蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白4下調(diào)可能與其心肌能量代謝降低有關(guān)，其機制有待進(jìn)一步深入研究。左室射血分?jǐn)?shù)反映了心功能的變化，也被作為心肌缺血氣虛證評價的主要指征之一［8］。本研究提示，左室射血分?jǐn)?shù)與差異蛋白Spot 22呈線性相關(guān)，差異蛋白Spot 22可能成為左室射血分?jǐn)?shù)用于氣虛證評價時的替代指征。

血瘀證診斷中，舌質(zhì)紫暗或舌體瘀斑、瘀點，舌下靜脈曲血是主要依據(jù)之一。本研究建立了rgb值定量分析小型豬舌色變化的方法［9］。本研究提示，Spot20、Spot 6、Spot 20分別與舌r、g、b值呈線性相關(guān)。盡管小型豬是心血管疾病最佳的動物模型，本研究也發(fā)現(xiàn)了一些與心肌缺血氣虛血瘀證及其宏觀表征相關(guān)的血漿蛋白。但是關(guān)于小型豬的基因背景的研究遠(yuǎn)不及小鼠等模式生物完善，其基因、蛋白數(shù)據(jù)庫的不完整，導(dǎo)致多數(shù)的差異蛋白未能獲得陽性的鑒定結(jié)果，大大限制了其后續(xù)的研究與應(yīng)用。本研究后續(xù)還需要進(jìn)一步采用其他方法進(jìn)行多維度的分析與驗證，上述候選的證候或宏觀表征特征性的血漿蛋白才可能真正應(yīng)用于臨床患者與實驗動物的證候辨識。

［1］ 王勇，李春，啜文靜，等.基于小型豬冠心病慢性心肌缺血模型氣虛血瘀證的證候評價［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31（2）：233-237.

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