原發(fā)性肝癌患者血清DJ-1蛋白的檢測(cè)意義

黃遠(yuǎn)虹 何顯龍

研究已證明，DJ-1基因在人體22個(gè)以上組織中廣泛存在，DJ-1基因較多的研究發(fā)現(xiàn)與帕金森病有關(guān)，認(rèn)為DJ-1基因的突變可導(dǎo)致早發(fā)性帕金森病的發(fā)生[1]。DJ-1（帕金森疾病相關(guān)蛋白）蛋白是種多功能蛋白質(zhì)，廣泛存在于胰腺、腎臟、肌肉、肝臟等多種器官，參與抑制凋亡、負(fù)性調(diào)節(jié)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化等過(guò)程[2]。近年來(lái)的研究表明，DJ-1蛋白在許多腫瘤中異常表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切相關(guān)[3]。本研究對(duì)正常人、乙型肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌患者血清中DJ-1蛋白的含量進(jìn)行比較，探討DJ-1蛋白在原發(fā)性肝癌診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年1～12月本院肝病住院患者150例，其中乙型肝炎50例，肝硬化50例，初診原發(fā)性肝癌50例。另選門診健康體檢者50例（男25例，女25例）為正常對(duì)照組，均符合1999年全國(guó)原發(fā)性肝癌診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)（草案）。

1.2 方法 標(biāo)本為清晨空腹采集血清，標(biāo)本無(wú)脂血，無(wú)溶血。離心分離后保存于-20℃條件下待測(cè)。DJ-1蛋白檢測(cè)采用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟為：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μL，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測(cè)樣品10μL（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30min。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。置37℃溫育30min，洗滌5次。每孔先加入顯示劑A50μL，再加入顯色劑B50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10min。每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。752N型紫外可見分光光度計(jì)為上海天普分析儀器，試劑盒購(gòu)自鄭州博賽生物試劑實(shí)驗(yàn)研究所，所有步驟均嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS17.0進(jìn)行分析，用單因素方差（one-way）分析各組之間差異性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

正常對(duì)照組血清中DJ-1蛋白含量為（5.76±1.35）ng/L、乙型肝炎組為（8.63±2.05）ng/L、肝硬化組為（8.98±1.59）ng/L、原發(fā)性肝癌組為（40±3.69）ng/L。乙型肝炎、肝硬化、肝癌組DJ-1蛋白的含量與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），肝癌組與肝硬化、乙型肝炎組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

研究表明，DJ-1蛋白在各種腫瘤組織中含量升高：Pardo等[4]首次發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的DJ-1蛋白及其抗體較非癌者明顯增多，且在此類患者的血清能檢測(cè)出DJ-1抗體。Le Naour等[5]發(fā)現(xiàn)眼葡萄膜惡性黑色素瘤能表達(dá)DJ-1蛋白，并且在此類患者的血清能檢測(cè)出DJ-1蛋白，認(rèn)為DJ-1蛋白是眼葡萄膜惡性黑色素瘤潛在的血清標(biāo)志物。DJ-1蛋白在宮頸癌組織中高度表達(dá)，認(rèn)為DJ-1蛋白可作為宮頸癌潛在病變期的檢測(cè)標(biāo)志物。吳芳等[6]的研究顯示，肝癌組織中DJ-1蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于癌旁肝組織。目前認(rèn)為DJ-1基因與惡性腫瘤的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)并可能是潛在抗癌治療靶點(diǎn)，其具體作用機(jī)制不清，DJ-1蛋白已成為研究的熱點(diǎn)。

在本研究中，選取初診原發(fā)性肝癌患者作為研究對(duì)象，并以正常人、乙型肝炎、肝硬化患者作為對(duì)照。本研究研究結(jié)果表明，DJ-1蛋白在原發(fā)性肝癌患者血清中含量顯著升高，與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示DJ-1蛋白可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)，其有望成為原發(fā)性肝癌診斷的一個(gè)潛在標(biāo)志物。

[1]Honbou K,Suzuki n N,Horiuehi M,et al.The crystal structure of DJ-1,a protein related to male fertility and Parkinson’s disease[J].Biol Chem,2003,278(33):31380-31384.

[2]嚴(yán)金金，舒寬勇，朱其舟.DJ-1與腫瘤的關(guān)系[J].廣東醫(yī)學(xué)，2011，12（3）：3147-3149.

[3]祝小林，雷文斌，何小洪.DJ-1蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌與Hep-2細(xì)胞系表達(dá)[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(2):142-144.

[4]Pardo M,García A,Thomas B,et al.The characterization of the invasion phenotype of uveal melanoma tumour cells shows the presence of MUC18 and HMG-1 metastasis markers and leads to the identification of DJ-1 as a potential serum biomarker [J].Int J Cancer，2006，119(5):1014-1022.

[5]Le Naour F,Misek DE,Krause MC,et al.Proteomics-based identification of RS/DJ-1 as a novel circulation tumor anti-gene in breast cancer[J].Clin Cancer Res，2001，7(11):3328-3335.

[6]吳芳，梁瑾琦，黃智銘.DJ-1基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其肝癌侵龔和轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].中華肝病雜志，2009，17（3）：203-206.