油茶果皮多酚粗提物對DNA 氧化損傷的影響

侍銀寶 鐘海雁

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

油茶屬山茶科植物，有“東方橄欖”之稱。在中國，油茶分布廣泛，具有悠久的栽培歷史。油茶果皮，又稱油茶蒲，作為油茶加工過程中的最大副產(chǎn)物，含有豐富的多酚類物質(zhì)，而多酚因具有清除與多種疾病相關(guān)的活性氧自由基的功能［1－3］，且具有獨(dú)特的藥理活性和生物活性［4－6］，已得到科學(xué)界的普遍關(guān)注。因此，油茶果皮中所含的多酚是一類值得開發(fā)的天然抗氧化劑。

目前對油茶果皮多酚的提取、成分分析、抗氧化性等已有初步的研究［7－11］。本研究擬利用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)（SCGE）探究 油茶果皮多酚粗提物（camellia pericarp polyphenol crude extracts，CPPCE）對H2O2誘導(dǎo)HUVEC DNA氧化損傷的保護(hù)作用，以及利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)（AGE），研究不同濃度的油茶果皮多酚粗提物對APPH 損傷質(zhì)粒DNA的保護(hù)作用，從而從細(xì)胞分子和分子水平上研究油茶中多酚的抗氧化性，為油茶的研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 材料與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）、pGL6質(zhì)粒：由中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院分子營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供；

低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠、正常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠、Triton－100：美國Sigma公司；

肌氨酸鈉：上海梯希愛公司；

APPH：上海Aladdin公司；

溴化乙錠：美國Fluka公司；

Tris堿：美國Genview 公司；

RPMI1640和胎牛血清：美國Gibco公司；

其他化學(xué)試劑：均為中國產(chǎn)分析試劑。

1．1．2 主要儀器設(shè)備

紫外分光光度計：UV－1800型，日本島津公司；

熒光顯微鏡：BX－51型，日本Olympus公司；

電泳儀：JY300C型，北京君意東方電泳設(shè)備儀器廠；

電泳槽：JY－SPCT 型，北京君意東方電泳設(shè)備儀器廠；

恒溫水浴鍋：HHD－2型，上海比朗公司；

高速離心機(jī)：5418R 型，德國Eppendorf公司；

冷凍干燥機(jī)：MODULYO 型，美國Thermo Fisher公司；

凝膠成像儀：Gel Doc型，美國伯樂公司。

1．2 方法

1．2．1 多酚純度的測定 采用福林酚法，以沒食子酸為標(biāo)品，測得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A ＝0．113 7C＋0．058 8，R2＝0．999 6，其中A 表示吸光值，C 表示沒子酸的濃度（μg／mL），多酚濃度計算公式見式（1）：

式中：

N—— 稀釋倍數(shù)；

A′—— 樣品稀釋液吸光值；

c′—— 樣品多酚濃度，mg／mL。

稱取一定質(zhì)量的凍干粉并復(fù)溶，復(fù)溶后多酚濃度按式（1）計算，其純度計算公式見式（2）：

式中：

c″—— 復(fù)溶后多酚濃度，mg／mL；

v—— 復(fù)溶后多酚的體積，mL；

m—— 稱取的凍干粉的質(zhì)量，mg；

w—— 多酚純度，%。

1．2．2 油茶果皮多酚提取物的制備以及純度的測定 稱取已曬干的新鮮油茶果皮，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過120目篩，按料液比1∶15（m∶V）加入70%的乙醇溶液，超聲時間40min，提取溫度35℃，然后真空抽濾，殘渣再用1∶15（m∶V）的料液洗滌，重復(fù)上述操作。合并提取液，于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。將濃縮液用D101大孔樹脂進(jìn)一步分離純化，得提取液，冷凍干燥制得多酚粗制品。稱取一定質(zhì)量的凍干粉并復(fù)溶，多酚純度按式（1）、（2）計算，得多酚純度為34．5%。

1．2．3 HUVEC 細(xì)胞的培養(yǎng) HUVEC 培養(yǎng)于培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為5%牛血清，1 000kU／L青霉素，100mg／L 鏈霉素）中，置于37 ℃，含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4d傳代1次。選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1．2．4 不同濃度的H2O2對HUVEC DNA 損傷的檢測

在24孔板上選取12個孔，隨機(jī)分為空白對照組，H2O2染毒組I、II、III，每組3孔，每孔各加入1mL 培養(yǎng)基（細(xì)胞密度為1×105個／mL），細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的H2O2（終濃度分別為25，50，100μmol／L）作用30min，之后用胰酶將每個孔里細(xì)胞消化取出，放入1．5 mL 離心管離心棄去上清液，SCGE檢測分析。

1．2．5 油茶果皮多酚提取物對HUVEC DNA 氧化損傷保護(hù)的檢測 取一塊24孔板，選取21個孔，隨機(jī)分為空白對照組，陽性對照組、陰性對照組I、II、III、IV、V，共7組，每組3孔，每孔各加入1mL培養(yǎng)基（細(xì)胞密度為1×105個／mL），細(xì)胞貼壁后，陰性對照組和陽性對照組均加入相應(yīng)濃度的油茶果 皮 多 酚 粗 提 物（終 濃 度 分 別 為50，100，500，1 000，1 500mg／L）。加藥1h后陽性對照組和陰性對照組均加入終濃度50μmol／L H2O2作用30 min，然后胰酶消化取出，放入1．5mL離心管離心棄去上清液。SCGE檢測（所有藥物均溶于DMSO，培基DMSO 含量均不超過1%，不會對細(xì)胞造成影響，且空白組與陽性對照組均加入同樣含量的DMSO）。

1．2．6 SCGE分析 將細(xì)胞調(diào)整到1×105個／mL 的密度，采用三明治式鋪膠法，待膠凝固后，浸入新配置的細(xì)胞裂解液（臨用前加10% DMSO，1% Triton 100，調(diào)節(jié)pH＝10）置于4 ℃冰箱中避光裂解1．5h，裂解完畢后取出置于新配置的電泳液（300mmol／L NaOH，1mmol／L Na2EDTA，pH＝13）中避光解旋15min，然后25V，300mA 下電泳10min，電泳結(jié)束后置于Tris－HCl（0．4mol／L，pH＝7．5）中浸泡15min，用超純水沖洗3次，無水乙醇浸泡5 min后晾干，用EB 染色，在熒光顯微鏡下采集圖片，隨機(jī)計數(shù)100 個細(xì)胞，用CASP軟件分析，以細(xì)胞拖尾細(xì)胞率、彗星尾長作為分析指標(biāo)。

1．2．7 油茶果皮多酚提取物對·OH 損傷質(zhì)粒DNA 的保護(hù)作用 根據(jù)文獻(xiàn)［11］，作如下修改：將100ng pGL6質(zhì)粒與溶于PBS（pH ＝7．4）的APPH 于37 ℃孵育0．5h，總體積25μL，抑制試驗(yàn)中待測試劑在加入APPH 之前加入，孵育之后立即點(diǎn)樣電泳（0．8%瓊脂糖以TEA 緩沖液配制），水平電泳1h，于凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察照相。

1．3 數(shù)據(jù)與結(jié)果分析

數(shù)據(jù)采用EXCEL進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用T 檢驗(yàn)對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，若P＜0．01差異極顯著，P＜0．05差異顯著，P＞0．05無顯著性差異。

2 結(jié)果

2．1 不同濃度的H2O2 對HUVEC DNA 氧化損傷的影響

經(jīng)熒光顯微鏡所采集的圖片分析發(fā)現(xiàn)，圖中細(xì)胞DNA被EB染成紅色，未損傷的DNA 是一個完整的接近圓形的頭部，而受損傷的DNA 則為彗星狀，空白對照組拖尾細(xì)胞量幾乎為0，而H2O2染毒組的拖尾細(xì)胞含量較高，且隨著H2O2濃度的加大（終濃度為25，50，100μmol／L），與空白對照組比較，拖尾細(xì)胞量隨之加大，彗星尾長也明顯隨之增長，當(dāng)H2O2損傷濃度為50μmol／L 時拖尾細(xì)胞率接近100%，而H2O2損傷濃度為100μmol／L時細(xì)胞全部損傷。故選擇H2O2終濃度為50μmol／L 為最佳損傷濃度（P＜0．01）見表1，圖1。

表1 H2O2 誘導(dǎo)HUVEC DNA 損傷SCGE檢測結(jié)果Table1 The SCGE analysed results Of HUVEC DNA damage induced by H2O2（X ±sd，n ＝100）

圖1 不同濃度H2O2 誘導(dǎo)HUVEC DNA 損傷的彗星圖片F(xiàn)igure1 Comet inmages of HUVEC DNA damage induced by different concentrations of H2O2

2．2 油茶果皮多酚粗提物對HUVEC DNA 氧化損傷的保護(hù)

經(jīng)分析采集的圖片發(fā)現(xiàn)，陰性對照組，加了不同濃度藥物預(yù)處理后，細(xì)胞拖尾率、彗尾長較之陽性對照組均明顯的下降，在50～500mg／L的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加抗損傷能力加強(qiáng)，與陽性對照組比較，有顯著性差異（P＜0．01或P＜0．05），說明油茶果皮多酚粗提物能顯著降低H2O2對HUVEC DNA 的氧化損傷，經(jīng)1 000mg／L 油茶果皮多酚粗提物預(yù)處理后，拖尾細(xì)胞率、彗尾長有所增加，但仍然具有一定的保護(hù)效果，但當(dāng)濃度達(dá)到1 500 mg／L 時，無保護(hù)效果，與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），見表2，圖2。

2．3 由APPH 引起的質(zhì)粒pGL6DNA 的斷裂

圖3顯示：APPH 可以引起質(zhì)粒DNA 的斷裂，未經(jīng)處理的質(zhì)粒只有環(huán)形結(jié)構(gòu)，電泳時跑在最前端，經(jīng)APPH 處理之后，環(huán)形DNA 殘留變少，直鏈型DNA 增加，且隨著APPH濃度的增加，環(huán)狀DNA 逐漸減少，鏈狀DNA 增加。B 和C泳道，DNA 殘留量相似，說明試驗(yàn)時的操作過程，幾乎不會改變質(zhì)粒pGL6 DNA 的結(jié)構(gòu)，最終選擇終濃度為10mmol／L的APPH 為損傷濃度。

表2 油茶果皮多酚粗提物對HUVEC DNA抗氧化損傷SCGE檢測結(jié)果Table2 The SCGE analyzed results of CPPCE antioxidant to HUVEC DNA damage induced by H2O2（X ±sd，n ＝100）

圖2 不同濃度油茶果皮多酚粗提物對H2O2（50μmol／L）致HUVEC DNA 損傷的彗星圖片F(xiàn)igure2 Comet images of H2O2－induced（50μmol／L）HUVEC DNA treated with different concentrations of CPPCE

圖3 不同濃度的APPH 對質(zhì)粒pGL6DNA 的損傷Figure3 pGL6plasmid DNA damage induced by different concentrations of APPH

2．4 油茶果皮多酚粗提物對質(zhì)粒DNA 的保護(hù)作用

由圖4可知，陰性對照組的環(huán)形質(zhì)粒含量比陽性對照組（10mmol／L APPH）的含量高，當(dāng)CPPCE的濃度為50 mg／L時保護(hù)效果不顯著，但隨著藥物濃度的增加，環(huán)形質(zhì)粒的含量在增加，且當(dāng)藥品濃度為1 500mg／L時，保護(hù)效果最為顯著，環(huán)形DNA 的含量幾乎與空白組相當(dāng)。充分說明了CPPCE具有清除自由基的作用，對DNA 氧化損傷具有顯著的保護(hù)效果。

圖4 不同濃度的油茶果皮多酚粗提物對APPH造成的DNA 損傷的影響Figure4 Effects of different concentrations of CCPCE on pGL6plasmid DNA damage induced by APPH（10mmol／L）

3 討論

本試驗(yàn)通過體外試驗(yàn)方法，利用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)（SCGE）驗(yàn)證油茶果皮多酚粗提物對細(xì)胞DNA 氧化損傷的保護(hù)作用。H2O2在細(xì)胞傳代過程中，通過氫氧基與DNA分子結(jié)合，經(jīng)過Feton反應(yīng)而引起DNA 片段的斷裂［12，13］。

H2O2＋Fe2＋→·OH ＋OH ＋Fe3＋

通過本研究發(fā)現(xiàn)：H2O2能顯著的增加細(xì)胞拖尾率和彗尾長，且隨著濃度的增加，損傷程度增加，確定了H2O2最佳損傷終濃度50μmol／L。而油茶果皮多酚粗提物在50～500mg／L濃度范圍內(nèi)，能顯著的降低H2O2的誘導(dǎo)損傷程度，表明油茶果皮多酚粗提物對H2O2誘導(dǎo)的DNA 損傷具有一定的保護(hù)作用，當(dāng)用1 000 mg／L 油茶果皮多酚粗提物預(yù)處理后，雖拖尾細(xì)胞率、彗尾長有所增加，但仍然具有一定的保護(hù)效果，當(dāng)濃度達(dá)到1 500 mg／L 時，無保護(hù)效果，可能是因?yàn)楦邼舛鹊挠筒瓒喾哟痔嵛镌黾親2O2對DNA 誘導(dǎo)損傷的敏感性，也可能與粗提物具有一定毒理作用有關(guān)。對于利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)研究的體外保護(hù)DNA 的研究發(fā)現(xiàn)，隨著CPPCE 濃度的增加，保護(hù)效果也在增加，說明了CPPCE具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，對DNA 的抗氧化損傷具有顯著的保護(hù)作用。

本研究從細(xì)胞分子以及分子水平上證明了油茶果皮多酚粗提物抗氧化作用，在一定的濃度范圍內(nèi)對氧自由基誘導(dǎo)的DNA 損傷具有保護(hù)作用，但對其保護(hù)作用機(jī)制以及是否是藥物中的多酚成分在起作用還有待進(jìn)一步的研究。

1 Xiao－Yu Su，Zhen－Yu Wang，Jia－Ren Liu．In vitro and in vivo antioxidant activity of pinus koraiensis seed extract containing phenolic compounds［J］．Food Chemistry，2009，117（4）：681～686．

2 Matkowski A．Plant in vitro culture for the production of antioxidants［J］．Biotechnology Advances，2008，26（6）：548～560．

3 Hatano T，Kusuda M，Inada K．Effects of tannins and related polyphenols on methicillin－resistant Staphylococcus aureus［J］．Phytochemistry，2005，66（17）：2 047～2 055．

4 Seerama N P，Adams L S，Henning S M．In vitro antiproliferative，apoptotic and antioxidant activities of punicalagin，ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are enhanced in combination with other polyphenols as found pomegranate juice［J］．Journal of Nutritional Biochemistry，2005，16（6）：360～367．

5 Bhupinder P S V，Satya P S，Vinod K K．Maharishi amrit Kalash rejuvenates ageing central nervous systen’s antioxidant defence system：an in vivo atudy［J］．Pharmacological Research，1999，40（6）：497～502．

6 KonatéK，Souza A．Polyphenol contents，antioxidant and antiinflammatory activities of six malvaceae species traditionally used to treat hepatitis B in Burkina Faso［J］．Eur．J．Sci．Res，2010，44（4）：570～580．

7 廖義秀，鐘海雁．茶油儲藏穩(wěn)定性及高校液相色譜分析［J］．食品與機(jī)械，2013，29（1）：173～176．

8 曾獻(xiàn)，袁英姿，曹清明，等．油茶籽多酚的提取研究［J］．食品與機(jī)械，2008，24（4）：69～72．

9 趙清潔，龍奇志，鐘海雁，等．半制備液相色譜法分離制備油茶果皮多酚的優(yōu)化條件［J］．經(jīng)濟(jì)林研究，2012，30（2）：73～77．

10 陳躍龍，唐玲，李紅兵，等．油茶果皮多元酚富集工藝研究［J］．時珍國醫(yī)國藥，2008，19（6）：1 369～1 370．

11 劉國安，楊艷，丁蘭，等．幾種天然抗氧化劑對DNA 氧化損傷的保護(hù)作用［J］．四川大學(xué)學(xué)報，2006，43（1）：238～241．

12 Silva E M，Souza J N S，Rogez H，et al．Antioxidant activities and polyphenolic contents of fifteen selected plant species from the Amazonian region［J］．Food Chemistry，2007，101（3）：1 012～1 018．

13 S J Duthie，A R Collins，G G Duthie，et al．Quercetin and myricetin protect against hydrogen peroxide－induced DNA damage（strand breaks and oxidised Pyrimidines）in human lymphocytes［J］．Mutation Research，1997，393（3）：223～231．