全脂乳粉需氧芽孢總數檢驗中不確定度的評定

楊 滔

（湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410111）

芽孢桿菌（Spore－forming Bacillus）能夠在特定環境條件下由其細胞質高度濃縮脫水而形成一種可以抵抗外界不利因素的特殊休眠體——芽孢（spore），根據其對氣體的需求類型可以分為需氧型和兼性厭氧型兩大類，根據其形態又可分為桿菌和梭菌。對熱、紫外線、電磁輻射和某些化學物質有很強抗性的芽孢可耐受各種不良環境，如可以在pH 為2．0～3．0的環境中生存，可以在溫度高達80 ℃甚至以上的條件下生長，南極寒冷的冰雪中也能見到他們的蹤跡［1］。因此芽孢桿菌對外界有害因子抵抗力較強，廣泛分布于土壤、水體、大氣以及動物胃腸道等，即使經過殺菌處理后的乳粉，仍有可能殘存一定量需氧型芽孢桿菌。在乳中，這些芽孢桿菌都會不同程度的引起乳及乳制品的變質，可以使鮮乳、酸奶中的蛋白質、脂肪分解，相應的會有蛋白質分解產生的腐敗味、脂肪分解產生的酸敗味，并導致原料乳產氣、產酸而變粘稠［2］。因此，芽孢數和耐熱芽孢數的多少決定企業制定的產品質量可接受水平（AQL）［3］，可以作為乳粉產品質量控制的一個必要的檢測指標。

測量不確定度的評定是實驗室質量管理體系的重要組成部分和實驗室質量管理的重要內容，測量結果都具有不確定度，當測量結果在標準值附近，客戶索要不確定度時，實驗室應在出具檢查報告中給出不確定度［4］。微生物檢測具有非嚴格性、非度量學和非統計學等有別于一般定量檢測的特點，因此本試驗單獨采用重復性和再現性數據來評定不確定度，但也考慮到了偏離。此外，試樣中的微生物一般以單個菌體或菌團的形式存在，其定量檢驗易受到培養基質量、操作環境、稀釋溶液、培養溫度、觀察結果時間和操作人員技能等因素的影響，使試驗檢測的結果離散度大，因此采用測試結果取對數的形式用于不確定度的評定。通過本試驗的探索和研究一方面可為包括芽孢計數在內的實驗室微生物定量檢測的準確度和精密度驗證提供理論依據和實踐指導，另一方面也可為乳制品中芽孢桿菌污染的監控及其可能造成品質問題的預警機制形成一定的理論基礎，為建立和完善乳制品生產中的全過程控制技術提供科學依據。

1 材料和方法

1．1 材料與設備

1．1．1 樣品

全脂乳粉：市售。

1．1．2 培養基

乳平板計數瓊脂（MPC）：青島海博生物技術有限公司。

1．1．3 主要儀器設備

多功能熱風循環烘箱：FED 240型，德國Binder公司；

生化培養箱：SPX－250B－Z型，上海博迅實業有限公司；

生物安全柜：SG603A－HE型，美國Baker公司；

全自動高壓蒸汽滅菌器：HV－85型，日本Hirayama公司；

電冰箱：BCD－170型，河南新飛電器有限公司；

生物顯微鏡：ECLIPSE 80i型，日本Nikon公司；

拍擊式均質器：Basic型，西班牙IUL公司。

1．2 方法

1．2．1 檢驗方法 依據農業部標準《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數的測定（NY／T 1331－2007）》第二部分進行檢驗，流程如圖1所示。

圖1 測定流程Figure1 Protocol of test

1．2．2 數學模型 設需氧芽孢總數為A，試驗結果為X，則：A ＝X CFU／g，最佳

1．2．3 不確定度來源及分析 本試驗的不確定度主要來源于取樣、重復性、培養條件、加熱條件、樣品保存條件，詳細描述見圖2［7，8］。

2 結果與分析

2．1 微生物檢測不確定度分析的特點

相對于化學物質、物理量值等其他類型的定量分析，微生物檢測中由天平最大容許誤差、稀釋和取樣過程等因素引入的不確定度都為對合成不確定度貢獻較小的B 類不確定度，可以忽略不計，因此A 類不確定度是需氧芽孢總數測定中主要引起的不確定。

圖2 不確定度的分量構成Figure2 Components of uncertainty analysis

2．2 重復測量結果的不確定度評定

對20份試樣進行重復檢測，由于微生物定量測試的數據發散性較大，直接采用貝塞爾公式計算將得到較大的合并樣本標準差，并且在出現較小樣本均值的情況下其不確定度反而會較大，因此在這種情況需要對試驗結果進行取對數的處理方式，再求得該樣本檢測結果對數值的均值和殘差平方和。表1即是測試的原始數據及其取對數后求得的均值和殘差平方和列表。

表1 檢驗結果及分析Table1 Results and analysis

檢測結果對數值標準偏差的合并樣本標準差可以通過貝塞爾公式求得：

擴展不確定度：U ＝KUc

取值水平P＝95%，v ＝20，查t分布表得：

2．3 報告結果

本試驗的檢測結果可以采用平行樣對數值的平均值或其反對數值即平行樣平均值兩種方式表達，前者取值區間在lgX±0．121 8之間，后者則為相對于對數值再取反對數得其取值區間分布。以1號試樣為例，其lgX ＝2．241，則其取值區間為［2．119，2．363］，取反對數得兩次測量平均值的取值區間為［132，231］CFU／g，那么根據本次測試方法所得的不確定度，第1次測試樣品需氧芽孢總數的測試結果可估算區間為［140，240］CFU／g。

3 討論

全脂奶粉需氧芽孢總數檢驗中涉及到的重復性、培養條件、取樣等因素為對合成不確定度貢獻較小的B類不確定度可以忽略不計，以重復測量帶來的不確定度為主，因此根據這一情況，本試驗采用統計學的方法（A 類）來評定測量的不確定度。

由于芽孢總數檢測數據發散性較大，直接采用貝塞爾公式計算將得到較大的合并樣本標準差，并且在出現較小樣本均值的情況下其不確定度反而會較大，因此應首先通過取對數的方式對本試驗產生的數據進行必要的處理之后，其測量不確定度再采用合并樣本標準差的方法求得。這種處理方式使用便捷，對于每一個獨立的測試對象均適用。此外，即使伴隨著樣本量的擴大，試驗數據的增加，依然可以在任何時候加入到合并樣本中，再次求得該合并樣本的標準差，從而相應地變更其測量不確定度的取值區間。

對于結果的表達方式，由于擴張不確定度U 只能表示為lgX 的取值區間，因此要得到微生物含量的可能區間須再對其取反對數。

1 陳霞，黃玉軍，王琴，等．熱處理條件對牛乳中耐熱芽孢致死效果的影響［J］．食品研究與開發，2006，32（2）：1～6．

2 韓永霞．牛乳中芽孢桿菌的動態變化及部分生物學特性的研究［D］．呼和浩特：內蒙古農業大學，2006．

3 韓雪，張蘭威．芽孢桿菌的檢測方法［J］．食品科學，2007，28（1）：347～350．

4 劉麗花，周紅，任永紅．菌落總數測定中的不確定度評定［J］．現代預防醫學，2007，34（17）：317～318．

5 陸霄芳．食品中菌落總數檢驗結果不確定度分析［J］．疾病監測與控制雜志，2012，6（9）：559～561．

6 李子江，林濤，鄧鐵娥．游泳池水中距離總數檢測確定度評定［J］．疾病監測與控制雜志，2012，6（7）：421～423．

7 王曉紅，姜嫻．食品中菌落總數檢測結果的不確定度評定［J］．中國衛生檢驗雜志，2011，21（11）：2 799～2 800．

8 凌云，王李寶，沈輝，等．食品中大腸菌群平板計數結果不確定度的評定［J］．食品與機械，2010，26（5）：75～77．