白金針菇液體菌種優良菌株選育

2013-03-20 11:37:56趙黎明

食品與機械 2013年6期

冀宏齊斌趙黎明

（1．天津大學管理與經濟學部，天津 300072；2．常熟理工學院，江蘇常熟 215500）

金針菇（Flammulina velutipes）學名毛柄金錢菌，又稱毛柄小火菇、冬菇、構菌、樸菌［1］。屬真菌門、擔子菌綱、傘菌目、金針菇屬。金針菇因其菌柄細長，似金針菜，故稱金針菇，以其菌蓋滑嫩、柄脆、營養豐富、味美適口而深受大眾喜愛，常用作涼拌菜和火鍋的上好食材。除具有很高的營養價值外還兼具藥用食療價值，研究［2－6］發現金針菇多糖有很強的免疫調節和抗腫瘤活性。

按子實體的色澤可將金針菇分為黃色品系、淺黃色品系和白色品系。白色品系菌蓋、菌柄純白色，絨毛少或無［7］，白色品系是金針菇工廠化生產主要品種［8，9］。目前，中國白金針菇工廠化生產普遍使用固體菌種技術，存在制種周期長、隱性污染幾率大、菌齡不齊難以標準化管理等弊端。興起21世紀初的液體菌種技術可為改變現狀、實現突破提供可行的技術方案。與固體菌種相比，液體菌種具有生產周期短、菌種純度高、接種后萌發生長迅速、菌絲體活力旺盛、使用成本低等明顯優勢，尤其適合大規模工廠化應用，性狀優良的液體菌種要求發酵生物量高、菌絲球直徑較小、密度較大、生長活力旺盛［10，11］。同工酶分析作為分子遺傳標記技術之一，不僅被廣泛應用于動植物的遺傳分析、生理生化研究，而且被作為化學分類的重要指標應用于真菌的分類鑒定中，是菌株分類鑒定和親緣關系研究的重要手段，廣泛應用于食用菌菌種鑒定及遺傳學研究［12，13］，關于同工酶在大型真菌分類鑒定中成功應用已有報道［14－16］。

本試驗收集了6株中國白金針菇產區的主要生產菌種，通過觀測和比較發酵菌絲體生物量、菌絲球直徑、密度及其生長活力等指標，綜合確定適合制備液體菌種的白金針菇優良菌株，旨在為工廠化生產白金針菇的液體菌種制備提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

1．1．1 供試菌株

試驗用斜面菌種（表1）：由常熟理工學院食用菌工程技術實驗室轉接并保藏。

表1 金針菇菌株編號Table1 The number of Flammulina velutipes strains

1．1．2 主要試劑

維生素B1、過硫酸銨、蔗糖、Tris、TEMED、Acr、Bis、甘氨酸、乙酸－1－萘酯、乙酸－2－萘酯、固蘭RR 鹽、丙酮、溴酚藍、石英砂等：分析純，中國醫藥集團上海化學試劑有限公司；

黃豆粉、玉米粉、馬鈴薯等：市購。

酯酶同工酶電泳的試劑：本實驗室參照文獻［13］自制。

1．1．3 培養基配方

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂2g，自來水100mL，pH 自然；

液體培養基：葡萄糖2g／100mL，玉米粉2．5g，黃豆粉1g，磷酸二氫鉀0．1g，硫酸鎂0．5g，維生素B15mg，自來水100mL，pH 自然。

1．2 儀器與設備

電子天平：M124A 型，伯拉莫貝林（上海）精密儀器有限公司；

便攜式（數顯）pH 計：FE20型，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

超凈工作臺：CJ－2S型，天津泰斯特儀器有限公司；

振蕩培養箱：ZQWY－200G 型，上海知楚儀器有限公司；

人工氣候箱：PQX－280A－22HM 型，寧波萊福科技有限公司；

高速冷凍離心機：Centrifuge 5418R 型，德國Eppendorf公司；

移液槍：100－1000型，Eppengorf中國有限公司；

垂直板電泳槽：DYCZ－24DN 型，北京六一儀器公司；

電泳儀：DYY－6C型，北京六一儀器。

1．3 方法

1．3．1 金針菇的液體培養按1．1．3配方配制培養基，滅菌結束后先冷卻再接種，以免培養基過燙殺死菌種；活化后的金針菇菌種從冰箱中拿出后要先置于25 ℃下復活2h左右，再無菌接種0．5cm×0．5cm 的菌種塊（10d菌齡）于搖瓶內，注意盡量使菌塊漂浮在液面上，每瓶接種2塊；25℃下靜置培養24h后，置于25 ℃恒溫振蕩培養12d［14］，搖床轉速180r／min。

1．3．2 金針菇液體菌種優良菌株的篩選

（1）菌絲球直徑的測定：隨機取菌球20個，將其排成一條直線，測其總長度，重復3次，取平均值［15］記為D，菌絲球直徑即d ＝D／20。

（2）菌絲球數量的測定：取10 mL 的發酵液，80目標準篩過濾，然后計數，此數值記為n 個。100mL 發酵液中菌絲球數目為N ＝10×n。

（3）菌絲體干重的測定：取10 mL 發酵醪液于80目標準篩過濾，用蒸餾水反復沖洗3次，將過濾所得的菌絲體于60 ℃數顯電熱鼓風干燥箱中烘干至恒重，用分析天平稱重，得到金針菇菌絲體細胞干重（md）［17］記為w，100 mL 發酵液中菌絲體的干重為W ＝10×w。

（4）活力值的測定：回接過程在超凈工作臺上進行，從培養12d的搖瓶中取直徑差不多大的菌絲球接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）上，菌種盡量接種到平皿中央，每個菌種做3個平行，并重復3次。置于25 ℃恒溫培養箱中培養，待菌絲在培養基表面開始生長，從第4天至第7天每隔24h用十字交叉法測定一次菌落直徑，計算菌絲體日均生長速度，同時觀察記載菌絲長勢，即菌絲濃密程度及色澤等［17］。

菌絲體日均生長速度按式（1）計算：

1．3．3 拮抗試驗取直徑90mm 的平皿，無菌條件下倒入PDA 培養基，待培養基凝固后，在同一PDA 平板上接種2個不同的菌種（兩點拮抗），兩兩接種塊之間間距1．5～2．0cm，25 ℃下恒溫培養，每天進行觀察，有染菌的平皿要及時清理以免污染未染菌的平皿，并記錄試驗結果。

1．3．4 酯酶同工酶譜分析酯酶同工酶電泳方法參照文獻［18－21］。

觀察樣品酶帶的位置，按式（2）計算每條酶帶的Rf值：

式中：

Rfn—— 條帶n 的遷移率；

dn—— 條帶n 的遷移距離，cm；

d—— 溴酚蘭的遷移距離，cm。

相似性判斷公式（3）：

式中：

Se—— 被檢樣品和標準樣品二者間相似系數；

Sxy—— 被檢樣品和標準樣品二者間共有酶帶數；

Sx—— 標準樣品特有酶帶數；

Sy—— 被檢樣品特有酶帶數。

2 結果與分析

2．1 金針菇品種之間的拮抗試驗

拮抗試驗是用來檢測地域差異較大菌株的方法之一，兩菌種之間的拮抗線越明顯，說明這兩個菌種之間的地域差異越大，親緣關系越遠。通過兩點拮抗試驗觀察（圖1）得到的試驗結果見表2。

圖1 拮抗試驗部分照片Figure1 The picture of antagonistic experiments

表2 金針菇品種間的拮抗試驗Table2 Antagonistic experiments Result of Flammulina velutipes

由圖1和表2可知，除品種2和品種3、品種1和品種4、品種6和品種4外，其余平皿中間均有明顯的拮抗線，說明其余品種之間的地域差異較大；而品種2和品種3、品種1和品種4、品種6和品種4之間的拮抗線不明顯，但拮抗線依然存在，說明這兩個品種之間的地域差異較小，親緣關系較近。

2．2 不同品種金針菇的酯酶同工酶譜的分析

酯酶同工酶電泳圖譜中譜酶帶的位置是由編碼各酶帶的基因直接決定的，所以從酶帶的位置可知道此6個品種金針菇的基因型是否有差異；同時，酶帶寬度和顏色深淺可表明酶的活性和含量［14］，同樣可作為判斷遺傳差異的依據。圖2是6個品種金針菇的酯酶同工酶譜鑒定結果，圖3中數據代表Rf值。

圖2 6個品種金針菇的酯酶同工酶圖譜Figure2 The result of esterase isoenzyme electrophoresis in 6varieties

圖3 6個品種金針菇的酯酶同工酶模式圖Figure3 The schema chart of esterase isoenzyme electrophoresis in 6varieties

各品種金針菇酶帶的遷移率見表3。由表3可知，有些菌株間酶譜差異較小，酶帶數相同，酶譜相似，而有些菌株間酶譜差異較大。其中有4條是6個品種均有的酶帶，可認為這4條酶帶是金針菇的基礎酶帶，個別菌株有其特征酶帶［21］。

表3 6個品種金針菇的酯酶同工酶條帶的遷移率Table3 The mobility comparison of esterase isoenzyme band in 6varietise

根據式（2）和（3）可計算出各品種之間的相似系數Se，相似系數表明了兩者之間的親緣關系。由表4可知，品種2和品種3、品種4和品種6之間的相似系數分別為0．923和0．933，從酶譜上（圖2和3）也可看出兩品種之間在酶帶數量和表達位置上只有1條譜帶之差，這說明了兩者遺傳基礎非常相似。其余品種之間的相似系數在0．667～0．857，表明兩品種之間的遺傳基礎有差異［22］。

表4 6個品種金針菇的酯酶同工酶的相似系數Table4 The similarity coefficient of esterase isoenzyme in 6varietise

酯酶同工酶譜分析得出的結論與拮抗試驗的結果基本吻合，說明6個品種之間存在或遠或近的親緣關系。

2．3 不同品種金針菇液體發酵的性狀

為篩選出適合液體發酵的品種，將發酵培養出的金針菇菌絲球的直徑、密度和干重作為篩選依據，不同品種金針菇液體發酵的性狀見表5。

表5 金針菇液體發酵菌株的性狀Table5 The screening basis of predominant strain of Flammulina velutipesin liquid culture（n ＝10）

由表5可知，各品種干重由大到小為品種6＞品種3＞品種2＞品種5＞品種1＞品種4。其中品種3和品種6的干重最大，分別為1．628g／100 mL 和1．662g／100 mL。液體發酵中干重∶濕重≈1∶9，干重約達到1．6g／100 mL，說明100mL培養基能培養出至少14．4g（鮮重）菌絲球。可初步判斷品種3和品種6較適合進行液體發酵。

對于液體發酵的菌絲球直徑一般要求在0．2cm 左右，6個品種菌絲體直徑由大至小依次為品種5＞品種6＞品種2＞品種1＞品種4＞品種3，除品種5外，其余5個品種的直徑都在0．2cm 左右，差別不大。重點研究品種3和6可發現，品種3的直徑是最接近要求。

對于液體發酵的菌絲球密度要求在3 000個／100mL左右，達到此要求的只有品種3，菌絲球密度由大至小依次為品種3＞品種4＞品種1＞品種6＞品種5＞品種2。品種2和5菌絲球密度分別為2 079，2 216個／100mL，除與所要求的3 000 個／100 mL 差別較大外，與其余4 個品種的差別也較大。

綜上所述，品種3的菌絲體直徑最小僅為0．203cm，且密度最大可達到3 045個／100mL、干重1．628g／100mL，是本試驗篩選出的優勢菌株；而品種6 的菌絲體直徑0．233cm、密度2 631個／100 mL、干重1．662g／100 mL，是本試驗篩選出的較優菌株。

2．4 不同品種金針菇菌株活力值

將發酵好的液體菌絲球回接到固體培養基上進行培養，以測定菌株活力值。本試驗測定了6個品種金針菇接種至平板后第4～7天的菌落半徑，并計算出日均生長速度，結果見表6。

表6 不同品種金針菇菌株菌絲體的生長情況Table6 The result of mycelial growth in six Flammulina velutipes（n ＝3）

由表6可知，6個品種生長速度由快到慢依次為品種2＞品種1＞品種6＞品種4＞品種5＞品種3。除了生長最快的品種2（生長速度0．535cm／d）和生長最慢的品種3（生長速度0．349cm／d）外，其余4個品種的平均生長速度差別不大。結合2．3得出的結論，可篩選出白金針菇液體發酵的優勢菌株為品種6，即河北金針菇。

3 結論

（1）本試驗篩選出了既適合液體發酵培養又能夠工廠化栽培高產的白金針菇優良菌株。通過液體發酵技術篩選出優勢菌株為日本白金金針菇和河北金針菇；再通過液體發酵菌絲球回接生長速度比較試驗確定河北金針菇為液體菌種優良菌株。

（2）酯酶同工酶電泳的鑒別方法和拮抗試驗都是鑒定菌種親緣關系的方法，但酯酶同工酶電泳準確度更高，表現出的信息也更多，后續試驗還可運用分子生物學手段進一步分析確定6個品種金針菇之間的遺傳關系。

（3）通過菌絲體回接試驗確定菌株活力值的方法還不夠完善，尚需進行工廠化出菇試驗才能準確測定液體菌種的生產性能。

1 王文亮，徐同成，劉麗娜，等．金針菇的保健功能及其開發前景［J］．中國食物與營養，2011，17（7）：18～19．

2 Ikekawa T，Ikeda Y，Yoshioka Y．The structure of EA3and further purification of EA5［J］．J．Pharm Dyn．，1982（5）：576～581．

3 曾慶田．金針菇多糖的抗腫瘤作用［J］．中國食用菌，1991，10（2）：11～13．

4 Gong F，Chen Y，Gong Y，et al．Crystallization and some characteriza－tion of Flammulin purified from the fruit bodies of Flammulinavelutipes［J］．Bioresource Technology，1998，64（2）：153～156．

5 Leung M，Fung K，Choy Y．The isolation and characterization of an immunomodulatory and antitumor polysaccharide preparation fromFlammulina velutipes［J］．Immunopharmacology，1997，35（3）：255～263．

6 嚴茂祥，陳芝蕓，項柏康，等．金針菇多糖對小鼠移植性腫瘤抗瘤效應研究［J］．中國中醫藥科技，1996，6（6）：379～380．

7 呂作舟．食用菌栽培學［M］．北京：高等教育出版社，2011：200～212．

8 沈秀榮．金針菇FV908 菌株液體培養工藝的研究［J］．微生物學雜志，2002（1）：18～19．

9 馬瑞霞，姚獻華，魏志華，等．白色金針菇液體菌種生產技術研究［J］．中國食用菌，2005，24（6）：16～17．

10 王謙，劉玉霞，劉會欣，等．金針菇的深層液體培養及應用［J］．湖北農業科學，2006，45（1）：84～85．

11 王洪波，趙從凱，郝會軍，等．金針菇液體發酵條件初探［J］．安徽農業科學，2009，37（1）：40～41．

12 劉祖同，羅信昌．食用蕈菌生物技術及應用［M］．北京：清華大學出版社，2002．

13 中華人民共和國農業行業標準．NY／T 1097－2006 食用菌菌種真實性鑒定酯酶同工酶電泳法［S］．北京：中國農業出版社，2006．

14 張長青，王紅英，張建民，等．適宜白靈菇菌絲生長條件的研究［J］．特產研究，2003（4）：12～14，18．

15 Royse D J，May B．Use of isozyme variation to identify genotypic classes of Agaricus brunnescens［J］．Mycologia，1982，74（1）：93～102．

16 Royse D J，May B．Genetic relatedness and its application in selective breeding of Agaricus brunnescens［J］．Mycologia，1982，74（4）：569～575．

17 王穩，朱忠貴，李萍萍．八個金針菇菌株液體培養與應用效果初報［J］．食用菌，2005，27（3）：18～19．