產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選及分類鑒定

滕志利 錢(qián) 方 姜淑娟 牟光慶

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

食品在加工與儲(chǔ)藏過(guò)程中，都不可避免會(huì)受到環(huán)境中微生物的污染，而引起腐敗變質(zhì)，長(zhǎng)期以來(lái)，食品工業(yè)都習(xí)慣于使用化學(xué)合成防腐劑，這些防腐劑對(duì)人體有一定的毒副作用［1］。乳酸菌素是由乳酸菌產(chǎn)生的一種具有活性的多肽或蛋白質(zhì)，對(duì)人體完全無(wú)毒副作用，而且能夠被人體吸收，其應(yīng)用前景越來(lái)越受到人們的關(guān)注［2］。中國(guó)對(duì)乳酸菌素的研究起步相對(duì)較晚，Nisin是目前研究最深入的乳酸菌素，但是Nisin的抑菌譜比較狹窄，所以其應(yīng)用范圍受到了一定的限制［3］。本研究旨在篩選出產(chǎn)廣譜細(xì)菌素（既抑制革蘭氏陰性菌又抑制革蘭氏陽(yáng)性菌）的乳酸菌菌株，并對(duì)其進(jìn)行分類鑒定。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 采集樣品

泡菜、酸菜、酸奶、奶酪：市售。

1．1．2 指示菌

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1．1．3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨1．0g、牛肉膏1．0g、酵母膏0．5g、K2HPO40．2g、檸檬酸二銨0．2g、乙酸鈉0．2g、葡萄糖2．0g、吐溫80 0．1mL、MgSO4·7H2O 0．058g、MnSO4·4H2O 0．025g、瓊脂1．5g，pH 6．8，蒸餾水100mL；

肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨1．0g、牛肉膏0．3g、氯化鈉0．5g，pH 7．2，蒸餾水100mL；

分離培養(yǎng)基：蛋白胨1．0g、牛肉膏1．0g、酵母膏0．5g、K2HPO40．2g、檸檬酸二銨0．2g、乙酸鈉0．2g、葡萄糖2．0g、吐溫80 0．1 mL、MgSO4·7H2O 0．058g、MnSO4·4H2O 0．025g、碳酸鈣0．5g、1．6%的溴甲酚綠乙醇溶液0．14mL、瓊脂1．5g，pH 6．5，蒸餾水100mL；

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨1．0g、牛肉膏0．3g、氯化鈉0．5g、瓊脂1．7g，pH 7．2，蒸餾水100mL［4］。

1．1．4 主要儀器與設(shè)備

恒溫磁力攪拌器：85－2型，鞏義市英峪予華儀器廠；

冷凍高速離心機(jī)：3－18K 型，德國(guó)Sigma公司；

精密pH 計(jì)：PHS－3C型，上海雷磁儀器廠；

手提式不銹鋼蒸汽消毒器：YX280A 型，上海三申醫(yī)療儀器有限公司。

1．2 方法

1．2．1 乳酸菌的分離 將泡菜汁（A）、酸菜汁（B）、酸奶（C）、奶酪汁液（D）各取1mL 左右加入到盛有9 mL 無(wú)菌生理鹽水試管中，連續(xù)10 倍遞增稀釋，取10－4，10－5，10－6稀釋液200μL，分別涂布于含有溴甲酚綠酒精溶液和碳酸鈣的MRS平板上，37℃培養(yǎng)48h。挑取鈣溶圈較大、培養(yǎng)基變黃的菌落，用平板劃線法在MRS平板上反復(fù)劃線分離，直至革蘭氏染色觀察中菌株顏色、大小、形態(tài)一致，選擇單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。將革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性菌株劃線接種到MRS 斜面培養(yǎng)，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?－7］。

1．2．2 產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的初篩

（1）發(fā)酵上清液的制備：用接種環(huán)挑取活化的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)48h，10 000r／min離心15min除去菌體，得到上清液。

（2）指示菌的培養(yǎng)和菌懸液的制備：將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌采用肉湯培養(yǎng)基，于37 ℃、160r／min搖床培養(yǎng)24h，通過(guò)傾注培養(yǎng)法測(cè)得兩種指示菌的菌液濃度，用無(wú)菌生理鹽水分別將它們稀釋成濃度為106個(gè)／mL 的菌懸液，4 ℃冰箱保存待用。

（3）抑菌試驗(yàn)：采用牛津杯雙層瓊脂擴(kuò)散法［8，9］。在已滅菌的平皿中倒入15mL 加熱融化的瓊脂（2%），完全凝固后，等距離放入滅菌牛津杯數(shù)個(gè)。將分裝于錐形瓶中的20mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基融化后冷卻至55 ℃左右，加入濃度為106個(gè)／mL指示菌菌懸液300μL，迅速混合均勻，倒入平皿。冷卻后，移去牛津杯，作為乳酸菌素活性檢測(cè)平板。取150μL乳酸菌發(fā)酵上清液，以無(wú)菌操作加入到檢測(cè)平板圓孔內(nèi)，同時(shí)做3組平行。37℃培養(yǎng)18h，量取抑菌圈直徑，選取小孔周圍有明顯抑菌圈的菌株待用。

1．2．3 產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的復(fù)篩

（1）酸排除試驗(yàn)：取pH 4．5作為無(wú)乳酸抑制作用的最小pH，用l mol／L NaOH 和1 mol／L HCl調(diào)節(jié)初篩菌株的發(fā)酵上清液pH 至4．5，以相應(yīng)pH 值的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，然后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，同時(shí)做3組平行。37℃培養(yǎng)18h，量取抑菌圈直徑［10］。

（2）過(guò)氧化氫排除試驗(yàn)：挑取排除酸作用后仍具有較強(qiáng)抑菌效果的菌株，將其發(fā)酵上清液于80 ℃加熱10 min后，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，同時(shí)做3組平行。37 ℃培養(yǎng)18h，量取抑菌圈直徑［10］。

（3）蛋白酶敏感性試驗(yàn)：挑取排除酸、過(guò)氧化氫干擾后抑菌活性最強(qiáng)的菌株進(jìn)行蛋白酶敏感性試驗(yàn)，將此菌株的發(fā)酵上清液的pH 值調(diào)到胰蛋白酶、木瓜蛋白酶作用的最適pH 值7．0，按終濃度為1 mg／mL 加入各酶，37 ℃溫育2h，將pH 值調(diào)到4．5后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，同時(shí)做3組平行。37 ℃培養(yǎng)18h，量取抑菌圈直徑［10］。

1．2．4 產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的分類鑒定 按照?qǐng)D1的鑒定程序區(qū)分不同的乳酸菌菌屬，并通過(guò)個(gè)體形態(tài)和菌落特征、生理生化特性等對(duì)種進(jìn)行鑒定。

圖1 乳酸菌屬鑒定程序［4，11］ Figure1 Identification procedure of Lactobacillus

2 結(jié)果與分析

2．1 乳酸菌的分離

從多種樣品中共篩選出30株乳酸菌，其中從泡菜中分離出17株、酸菜汁中7株、酸奶中4株、奶酪中2株。它們的菌落為乳白色或略顯黃色，光滑、濕潤(rùn)，邊緣整齊，菌落凸起，革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性，菌落周圍的鈣溶圈較大，且能使含有溴甲酚綠酒精的MRS培養(yǎng)基變成黃色，這些都符合乳酸菌的特征。

2．2 產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的初篩

從30株乳酸菌中篩選出8株對(duì)兩種指示菌均有較強(qiáng)抑制作用的菌株，它們分別來(lái)源于泡菜（A）、酸菜汁（B），編號(hào)分別為A1、A5、A8、A9、A10、A13、B1、B5，抑菌結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，所篩選出的8株乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果好于金黃色葡萄球菌。乳酸菌素的抑菌譜普遍較窄，一般僅對(duì)有親緣關(guān)系的種有抑制作用，所以此次篩選出的乳酸菌菌株具有廣譜抑菌作用，既抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，又抑制革蘭氏陰性菌。

2．3 產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的復(fù)篩

2．3．1 酸排除試驗(yàn) 乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)指示菌的抑制作用可能是乙酸、乳酸等某些有機(jī)酸作用，也可能是代謝合成的細(xì)菌素引起的，當(dāng)pH 值為4．5時(shí)，可排除有機(jī)酸的干擾，調(diào)節(jié)試驗(yàn)篩選菌株發(fā)酵上清液的pH 為4．5 后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。指示菌經(jīng)過(guò)18h培養(yǎng)后觀察（見(jiàn)圖3），對(duì)照孔（pH 為4．5的MRS液體培養(yǎng)基）周圍沒(méi)有出現(xiàn)抑菌圈，而8株菌中仍有5株菌對(duì)指示菌有一定抑制作用，說(shuō)明這5株菌的發(fā)酵上清液中除有機(jī)酸外還存在其它抑菌活性物質(zhì)。

圖2 初篩乳酸菌抑菌活性Figure2 The inhibitory activity of preliminary screening lactic acid bacteia

圖3 各菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性（pH 4．5）Figure3 The inhibitory activity of fermented supernatant for several bacterial strain

2．3．2 過(guò)氧化氫排除試驗(yàn) 乳酸菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫也可能抑制微生物的生長(zhǎng)，故將上述5株菌的發(fā)酵上清液經(jīng)80 ℃加熱處理10min，使過(guò)氧化氫充分分解，冷卻后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。抑菌結(jié)果表明（圖4），只有乳酸菌A5和A9的發(fā)酵上清液對(duì)兩種指示菌的抑菌活性變化較大，由此可知，乳酸菌A1、A8、B1的發(fā)酵上清液抑菌效果不是過(guò)氧化氫的作用，可能含有其它抑菌物質(zhì)。

2．3．3 蛋白酶敏感性試驗(yàn) 從乳酸菌A1、A8、B1中挑取抑菌作用最強(qiáng)的乳酸菌A8進(jìn)行酶解試驗(yàn)，按終濃度為1mg／mL將胰蛋白酶、木瓜蛋白酶加入到乳酸菌A8的發(fā)酵上清液中，然后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。由表1可知，乳酸菌A8的發(fā)酵上清液經(jīng)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶作用后，對(duì)兩種指示菌的抑菌活性完全喪失，表明此抑菌物質(zhì)是一類細(xì)菌素。

圖4 各菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性（80 ℃、10min）Figure4 The inhibitory activity of fermented supernatant for several bacterial strain

表1 乳酸菌A8 的發(fā)酵上清液蛋白酶敏感性試驗(yàn)Table1 The susceptibility of fermented supernatant for Lactic acid bacteria A8to protease ／mm

2．4 產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌A8 的分類鑒定

2．4．1 個(gè)體形態(tài)和菌落特征 由圖5、6可知，篩選乳酸菌A8，其菌體細(xì)胞呈桿狀，單個(gè)、成對(duì)或成鏈狀排列，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，無(wú)芽孢；菌落表面光滑、邊緣整齊、乳白色不透明，這與乳桿菌較相似。

2．4．2 生理生化特性 乳酸菌A8的生理生化特性結(jié)果見(jiàn)表2。過(guò)氧化氫試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)均呈陰性，不產(chǎn)硫化氫，pH 4．5能生長(zhǎng)，乳酸菌A8符合乳桿菌屬的生物學(xué)特性（圖1）。同時(shí)它能夠發(fā)酵果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、甘露醇、棉籽糖、山梨醇，不能發(fā)酵阿拉伯糖和木糖，參照文獻(xiàn)［4］可知，乳酸菌A8的糖

圖5 乳酸菌A8 的菌落特征Figure5 The colony of Lactic acid bacteria A8

圖6 乳酸菌A8 倍的菌體形態(tài)（10×100）Figure6 The thallus of Lactic acid bacteria A8

表2 乳酸菌A8 的生理生化特性Table2 Physiological and biochemical characteristics of Lactic acid bacteria A8

類發(fā)酵特性與植物乳桿菌（L．plantarum）、戊糖乳桿菌（L．pentosus）等菌株比較相似。

綜上，它與植物乳桿菌（L．plantarum）個(gè)體形態(tài)、菌落特征和生理生化特性基本相同，確定乳酸菌A8為植物乳桿菌，將其命名為L(zhǎng)actobacillus plantarum A8。

3 結(jié)論

本研究從多種樣品中篩選出30株乳酸菌，排除發(fā)酵上清液中有機(jī)酸、過(guò)氧化氫的影響后篩選得到1株分離自泡菜的具有較強(qiáng)抑菌活性的乳酸菌A8；通過(guò)蛋白酶敏感性試驗(yàn)確定該菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)為具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的細(xì)菌素，結(jié)合生理生化特性和形態(tài)學(xué)觀察，初步確定乳酸菌A8為植物乳桿菌（L．plantarum）。 目前，細(xì)菌素大多僅僅抑制同種的或親緣關(guān)系較近的細(xì)菌，而植物乳桿菌A8所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌譜較廣，并且對(duì)人體安全無(wú)毒，能夠被消化系統(tǒng)的蛋白酶分解成各種氨基酸而被人體吸收，所以它作為一種天然、高效、安全的新型防腐劑，有著廣闊的應(yīng)用前景。

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