人源性發酵乳桿菌f5降解大鼠膽固醇的研究

黃玉軍 梁文星 劉 冬 陳大衛 顧瑞霞

（揚州大學江蘇乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州 225009）

流行病學和臨床研究的結果［1］表明：人體膽固醇含量與心血管疾病之間存在著顯著的正相關。世界衛生組織（WHO）預測［2］，至2030年，將有近2 360萬人將死于心血管疾病。雖然藥物治療有一定的療效，但也有一些副作用。因此，人們試圖尋找更多的安全途徑來治療高膽固醇血癥。

益生菌是一類能夠對人體健康起到促進作用的活體微生物。迄今為止，已發現其具有多種生物活性［3，4］，其中降低血清膽固醇水平是其重要的生理活性之一。自從1963年Shaper［5］和Mann等［6］發現L．acidophilus 發 酵 酸 奶 對 非 洲部落成年男性血清膽固醇水平具有潛在的調節功能后，對具有降解膽固醇益生菌的篩選及作用機理的研究變得越來越廣泛。近年來，研究者已從動物腸道及傳統發酵制品中篩選出了許多具有降膽固醇功能的菌株，主要包括嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、加氏乳桿菌、屎腸球菌、長雙歧桿菌和乳雙歧桿菌等［7－9］。2000年5個國際研究機構對丹麥 MD 食品公司生產的Gaio 酸奶（由E．faecium 和St．thermophilus 混合發酵）進行了降膽固醇性能研究［10］，結果顯示Gaio酸奶對人體血清TC 和LDL－C水平的降低幅度分別達4%和5%，這些研究結果為預防和治療高血脂癥等疾病提出了新的理念和可能途徑。

本課題組前期已通過人工模擬胃、腸道環境，從江蘇如皋長壽人群腸道中篩選出一株耐酸、耐膽鹽及體外降膽固醇能力較好的乳酸菌。本試驗主要研究該菌在大鼠體內的降膽固醇特性，為乳酸菌的人體臨床試驗奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

1．1．1 菌株

試驗菌株：分離自江蘇如皋長壽人群腸道的發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum ）。

1．1．2 主要試劑

脫脂乳粉、濃磷酸、濃硫酸、無水乙醇、氯化鈣、三氯化鐵、甲醇、氯仿、膽固醇、Trition－100、石油醚等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

總膽汁酸試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1．2 主要試驗儀器

可見光分光光度計：722 型，上海精密科學儀器有限公司；

超聲波細胞粉碎機：SCIENZ－ⅡD 型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH－6型，國華電器有限公司；

生化培養箱：WS2－134－75型，上海新苗醫療器械制造有限公司；

高速冷凍離心機：5804R 型，德國Eppendorf公司；

生化培養箱：WS2－134－75型，上海新苗醫療器械制造有限公司；

全自動滅菌鍋：JF－SX－500型，日本Tomy公司；

酶標儀：Bio－Tek ELX800型，美國寶特公司；

透射電子顯微鏡：Tecnai 12型，荷蘭Philips公司。

1．3 灌胃菌液的制備

（1）菌懸液組：將活化三代的菌株以5%接種量接種于2L MRS液體培養基中，培養24h；將培養液4 000r／min離心5min，收集菌體于10%脫脂乳中，用生理鹽水稀釋至108，107，106CFU／mL 作 為 高、中、低 濃 度 的 菌 液 進 行 灌胃［11］，根據大鼠體重進行灌胃，灌胃量為2．0mL／100g。

（2）發 酵 乳 組：按4% （V／V）的 量 接 種 到 脫 脂 乳 中37 ℃發酵6h 后灌胃，根據大鼠體重進行灌胃，灌胃量為2．0mL／100g。

1．4 試驗動物分組及飼養

初斷乳雄性3周齡SPF 級Wistar大鼠，由揚州大學比較醫學中心提供，合格證：SCXK（蘇）2007－0001；基礎飼料、高脂飼料均由江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司提供；大鼠飼養及試驗均在本院實驗動物房內進行，動物房保持通風、透光和清潔衛生，大鼠每天自由進食、進水。

Wistar大鼠雌雄各30只，普通飼料適應性飼養4d后，隨機分為8組，每組10只。按照表1的方案，連續28d在上午對大鼠灌胃，參考《保健食品檢驗與評價技術規范（2003年版）》建立高脂血癥大鼠模型。

1．5 樣本處理

1．5．1 血清處理 大鼠最后一次灌胃后禁食12h，摘眼球取血，血液室溫放置60min，3 000r／min 離心10～15 min，取上清液分裝于塑料試管中，置－20 ℃冰箱，備用。

表1 試驗動物分組及飼養方式Table1 Animal grouping and feeding styles

1．5．2 肝勻漿制備 大鼠頸椎脫臼處死，迅速摘取肝臟左葉在預冷的生理鹽水中漂洗數次，濾紙吸干，稱取0．8g左右的組織塊，加入約為組織塊重量9倍的預冷生理鹽水充分研碎，制成10%肝組織勻漿。

1．5．3 糞便中膽汁酸的提取 在試驗的最后3d，每天隨機收集各試驗組的糞便，烘干至恒重；取2g干糞用無水乙醇80 ℃提取3次，置旋轉蒸發儀40～50 ℃蒸干，加入石油醚，充分混勻，留沉淀；用含2% Trition－100的乙醇溶解沉淀，取上層液，再在水浴鍋中80 ℃蒸干得沉淀，最后用蒸餾水溶解，即為提取的糞膽汁酸溶液。

1．6 測定指標和方法

1．6．1 血清TC、TG、HDL－C 和LDL－C 的測定 將冷藏血清送揚州中醫院血液檢驗科檢驗，并按式（1）、（2）計算動脈粥樣硬化指數及抗動脈粥樣硬化指數。

式中：

AI—— 動脈粥樣硬化指數；

AAI—— 抗動脈粥樣硬化指數；

TC—— 血清總膽固醇，mmol／L；

HDL－C—— 高密度脂蛋白，mmol／L。

1．6．2 糞便中膽汁酸的測定 用總膽汁酸試劑盒測定總膽汁酸含量［12］。

1．6．3 肝臟和糞便中膽固醇含量的測定 取0．1mL 肝勻漿 加 入4．9mL 無 水 乙 醇 混 勻，室 溫 放 置10 min，4 000r／min離心10min，取上清2mL加入磷硫鐵2mL 顯色，560nm 波長下測各樣本吸收值。

取0．3g 粉末狀的干燥糞便，用甲醇與氯仿（2∶1）的混合物定 容 至3 mL，45 ℃水 浴1h 后，8 000r／min 離 心10min，取上清0．2mL加入3．8mL無水乙醇混勻，取2mL溶液加入2 mL 磷硫鐵顯色，560nm 波長下測各樣本吸收值。

1．6．4 透射電鏡標本制備 取大鼠肝左葉和心臟相同部位，戊二醛固定，Epon 812、環氧樹脂包埋，切成5μm 薄片，醋酸鈾、硝酸鉛雙層染色后電鏡透射觀察肝臟、心臟切片［13，14］。

1．6．5 試驗數據分析與統計 應用SPSS 19．0 系統統計軟件對各試驗數據進行方差分析，在P＜0．05 的水平下，進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2．1 f5菌株對各組大鼠臟器系數的影響

試驗期間，各組小鼠毛色光潔、食欲正常、精神活躍，未出現異常體征，未發生自然死亡。小鼠體質量及肝、腎、心、脾與體質量的百分比見表2。

表2 f5菌株對大鼠體質量及臟器質量與體質量比的影響Table2 Effect of strain f5on body weight and viscera weight of rats with hyperlipemia（x±sd，n ＝10） ／（10－2 g·g－1 ）

正常試驗動物各臟器與體重的比值較為恒定，而當動物臟器病變后，受損臟器重量可能發生改變，故臟體比也隨之發生改變。臟體比增大，表示臟器可能已經充血、水腫或增生等；臟體比減小，表示臟器已經萎縮或發生其它改變。

由表2可知，與對照組相比，模型組的臟器與體重的比值顯著增高（P＜0．05），這說明了高膽固醇飼料的喂養使脂肪在大鼠肝臟上堆積，造成了肝臟重量增加。不同劑量的菌懸液組和發酵乳組與模型組相比，具有顯著性差異（P＜0．05），而與對照組相比無顯著性差異（P＞0．05），表明菌株能夠有效地降低肝臟脂肪的堆積。各組間的腎臟、心臟、脾臟的臟器系數數無顯著性差異（P＞0．05），說明菌株未使試驗動物臟器產生病變。

2．2 f5菌株對高脂血癥大鼠血脂的影響

由表3可知，與模型組相比，高、中、低濃度組和發酵乳組的TC 和TG 的濃度都有所下降；其中高濃度組和發酵乳組與模型組相比，有顯著性差異（P＜0．05），中、低劑量組的TC和TG 水平也有所降低，但與模型組相比，無顯著性差異（P＞0．05）。

與模型組相比，灌胃組的LDL－C 都顯著下降（P＜0．05），劑量越高，效果越顯著；在整個試驗中，HDL－C 都保持著相對比較穩定，沒有顯著性升高和降低，這與謝寧的乳酸桿菌對高脂飲食大鼠膽固醇影響的研究結果［15］一致，飼喂高脂飼料大鼠的HDL－C 比飼喂普通飼料的HDL－C 濃度高，這可能是由大鼠體內血清總膽固醇升高引起的，因為HDL－C在生理上起著將肝外組織的膽固醇運送到肝臟內部的作用，因此，當游離膽固醇在肝外組織細胞上沉積時，HDL－C就會增多，以防止其沉積。

與模型組相比，灌胃組的AI、AAI指數都有所下降，其中高、中濃度組和發酵乳組有顯著性差異（P＜0．05），但是低濃度組差異性不顯著（P＞0．05），表明f5菌株的高、中濃度菌懸液組和其發酵乳皆具有一定的調節血脂的功效，對于預防心血管疾病具有顯著效果。

2．3 f5菌株對大鼠肝臟中膽固醇含量的影響

肝臟可以將膽固醇轉化為膽汁酸，經腸道排出體外。由表4可知，模型組肝臟中的膽固醇含量顯著高于對照組（P＜0．05），說明喂養高脂飼料使肝臟中膽固醇含量增高；高、中濃度組和發酵乳組的肝臟膽固醇含量顯著低于模型組（P＜0．05），說明菌株f5 對大鼠的肝臟分解膽固醇具有促進作用，能夠通過肝臟將膽固醇轉化和分解。

表3 f5菌株對大鼠血脂的影響Table3 Effect of strain f5on blood lipids in rats（x±sd，n ＝10）

表4 肝臟中膽固醇的含量Table4 The content of liver cholesterol（x±sd，n ＝10）

2．4 f5菌株對大鼠糞便中膽固醇和膽汁酸含量的影響

由表5可知，與對照組相比，模型組的糞便膽固醇和膽汁酸含量均有顯著性差異（P＜0．05），灌胃后，高、中濃度組和發酵乳組的糞便膽固醇和膽汁酸的含量都有明顯升高（P＜0．05），說明體內膽固醇的降解可以通過形成糞便排泄出體外，也可以形成膽汁酸排出體外。

表5 糞便中膽固醇和膽汁酸的含量Table5 The contents of cholesterol and bile acid in feces（x±sd，n ＝10） ／（mg·g－1 ）

2．5 對不同組別大鼠肝臟、心臟切片的觀察

不同組別肝臟組織切片如圖1所示，對照組中肝臟組織中無脂肪變性，肝臟的整體結構正常，肝細胞呈索狀排列，在中央靜脈周圍呈放射狀分布；模型組中的脂肪泡明顯比正常組多，密度顆粒都比較大。在相同的放大倍數下，可發現高濃度組脂肪顆粒明顯下降，幾乎接近對照組；而低濃度組中肝臟細胞中的脂肪空泡仍然較多。

不同組別心臟組織切片如圖2所示，對照組中心肌纖維組織排列整齊，且線粒體均勻分布，無細胞膜破裂，模型組中線粒體明顯增多，且聚集在一起，線粒體增多可能由于缺氧造成，高膽固醇可能引起心血管堵塞而造成供氧不足；高濃度組中肌纖維排列整齊，且線粒體較高脂組有明顯降低，且均勻分布在肌纖維中；低濃度組中線粒體比較多，分布較雜亂，進一步導致了嵴斷裂。

圖1 肝臟組織切片電鏡透視圖（×650 000）Figure1 Transmission electron microscope photos ofrats liver slice

圖2 心臟組織切片電鏡透視圖（×650 000）Figure2 Transmission electron microscope photos ofrats heart slice

3 結論

同化作用和共沉淀作用是乳酸菌體外降膽固醇水平的兩個重要機制［16，17］。而對體內研究應從膽固醇在體內的代謝平衡角度加以考察，即從膽固醇的合成與降解兩個方面來研究。本研究認為發酵乳桿菌能通過促進糞便排泄來降解大鼠體內膽固醇的含量。當然，與模型組相比，試驗菌株的發酵乳及高濃度菌懸液能顯著降低大鼠的LDL－C、TC、TG水平及AI、AAI指數和大鼠肝臟的膽固醇含量（P＜0．05），但與對照組相比，改善效果并不明顯，這可能是由于干預各組飼料均為高脂飼料，大鼠體內膽固醇合成速度大于乳酸菌降解速度；通過電鏡透視還發現，高濃度的菌懸液能促進模型組大鼠心臟肌纖維的整齊排列、線粒體的均勻分布，且肝臟脂肪顆粒幾乎接近對照組。后續研究中將重點研究乳酸菌降低血清膽固醇的生化機理及對降解途徑的影響。

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