霉菌毒素在肉雞體內的殘留及其控制研究

黃曉琳 曲道峰 韓劍眾

(浙江工商大學食品質量安全系浙江省食品安全重點實驗室，杭州 310035)

霉菌毒素是飼料或谷物中霉菌所產生的次級有毒代謝產物，在各種食品與飼料中廣泛存在和危害最大的霉菌毒素一般認為有黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、赭曲霉毒素 A(Ochratoxin A，OTA)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)、T－2毒素等。霉菌毒素對人和動物具有廣泛的毒性作用，急性中毒會嚴重損害機體的健康狀況，并最終導致動物死亡；亞急性中毒會使動物的生長受阻，免疫功能受損等；慢性中毒則可能會引發腫瘤。飼料霉變產生的霉菌毒素除嚴重影響畜禽生產性能外，還可造成霉菌毒素在體內各組織器官的殘留，進而影響動物源性食品的安全[1]。目前已經發現黃曲霉毒素廣泛存在于牛乳、乳酪、玉米、花生、香料及其他各種飼料與食品中，然而對于霉菌毒素在體內組織器官的殘留研究報道很少。

對霉菌毒素及其體內殘留控制的方法主要是在飼料中添加霉菌毒素吸附劑[2－3]，常用的有天然鋁硅酸鹽類無機吸附劑(如膨潤土、沸石、蒙脫石等)和酵母細胞提取物類有機吸附劑(如葡甘露聚糖)等，然而目前市場上霉菌毒素吸附劑種類繁多，吸附效果相差很大。本試驗采用以改性前后蒙脫石為主要成分的霉菌毒素吸附劑，研究改性前后的蒙脫石在肉雞體內對霉菌毒素的吸附效果，并初步探討其作用機理，為新型飼料添加劑的開發研制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

霉菌毒素:利用玉米霉變制備。在30℃、濕度80%條件下，玉米粉含水量20%，每天翻混1～2次，連續7 d，烘干備用。經檢測，霉變玉米粉含AFB182.36 ng/g，OTA 41.56 ng/g，ZEA 915.4 ng/g。霉變日糧是由霉變玉米替代基礎日糧中的正常玉米制成。

試驗肉雞:13日齡三黃雞，平均體重216 g左右，余姚格格畜禽養殖有限公司。

霉菌毒素吸附劑A的主要成分是純化的鈉化納米蒙脫石、吸附劑B的主要成分是改性蒙脫石及部分酵母細胞壁提取物，江西中科聯合生化營養有限公司。

霉菌毒素由酶聯免疫試劑診斷盒檢測:山西德豐信成生物科技有限公司；Infinite 200酶標儀:瑞士Tecan公司。

1.2 試驗設計

選取210只13日齡三黃雞肉仔雞，隨機分為7組，每組3個重復，每個重復10只。正式試驗開始時，先進行預備試驗7 d。具體分組如表1。

表1 試驗日糧

第20日齡開始飼養試驗，試驗期為21 d，肉雞平均體重為(344.67±1.53)g，各處理組的日糧配方和營養水平完全相同，見表2。

表2 日糧組成和營養水平

1.3 飼養試驗

水泥地面按飼養要求用尼龍網分隔21組，平養，每組10羽。試驗前雞舍、雞籠進行徹底清掃，熏蒸消毒；自由采食和飲水，常規免疫。試驗結束后記錄肉雞最終體重及采食量，計算料重比。

1.4 肝腎及糞便樣品的采集

肝臟、腎臟采集:每個重復隨機選取2只雞，頸靜脈放血致死，經正常宰殺，迅速打開腹腔，采集肝臟、腎臟、放入培養皿中用預冷的生理鹽水清洗干凈，用濾紙擦去多余的液體放入－20℃冰箱保存待測。

糞便采集:于試驗開始第2天，每天以重復組為單位收集糞便，－20℃保存。將20 d收集的糞樣品混勻，糞樣65℃鼓風干燥，粉碎，裝入取樣袋內封存待測。

1.5 霉菌毒素檢測

采用酶聯免疫試劑盒測定，AFB1、OTA試劑盒的檢測限為0.1 ng/g，ZEA試劑盒的檢測限為1 ng/g。

肝臟、腎臟樣品預處理:稱取5 g勻漿樣品于125 mL具塞錐形瓶中，準確加入60%甲醇水溶液25 mL和20 mL正己烷加塞震蕩10 min，過濾，收集濾液于分液漏斗中，靜置分層；待下層甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一錐形瓶中。吸取10 mL甲醇水提取液于125 mL分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，加塞輕輕振搖3 min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，取10 mL于20 mL蒸發皿中，65℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入60%甲醇水溶液5 mL，將蒸發皿中的凝結物充分溶解。取濾液2 mL，加入6 mL 20%甲醇水溶液，混勻(若渾濁用濾紙過濾)，此為肝臟、腎臟待檢液。糞便樣品前處理:稱取5 g粉碎樣品于100 mL帶塞三角瓶內，準確加入5倍體積60%甲醇/水溶液。將上述帶塞三角瓶放入振蕩器內振蕩，充分振蕩3 min，用濾紙過濾，收集濾液。取濾液2 mL，加入2 mL蒸餾水，混勻，此為糞便待檢液，按說明書的方法步驟進行測定肝臟、腎臟及糞便中AFB1、OTA、ZEA的含量，每個樣品平行2次。

1.6 數據處理

數據采用SPSS17.0統計進行單因素方差分析，同時進行Duncan多重比較并做顯著性差異檢驗，以P＜0.05為顯著水平。

2 結果與分析

2.1 飼養試驗

飼養試驗結果見表3。

由表3可知，與對照比相比，試驗組Ⅰ肉雞的生長速度降低，料重比升高(P＞0.05)、試驗組Ⅱ肉雞的生長速度顯著降低，料重比顯著升高(P＜0.05)。表明霉菌毒素可嚴重影響肉雞的生長性能，且隨著毒素含量增加影響越顯著。

添加霉菌毒素吸附劑后，體重與料比均有一定程度的改進。從試驗結果看，吸附劑B可有效吸附飼料中的霉菌毒素，改善肉雞生長；吸附劑A有一定的效果，但效果不明顯。無論飼料中霉菌毒素含量水平如何，吸附劑B效果明顯，肉雞體重顯著升高，料重比顯著降低(P＜0.05)；試驗組Ⅵ與試驗組Ⅱ相比，肉雞體重顯著升高(P＜0.05)，料重比降低(P＞0.05)，與對照比相比，試驗組Ⅴ、Ⅵ的料重比無顯著性差異(P＞0.05)。這表明霉菌毒素吸附劑B有效的阻止了霉菌毒素對肉雞生長性能的影響。

表3 飼養試驗結果

表4 肝、腎及糞便中霉菌毒素的含量

2.2 飼糧不同含量的霉菌毒素在肉雞肝腎內的殘留

各試驗組的肝、腎的霉菌毒素含量結果見表4。

由表4可知，對照組的肉雞肝腎臟中未檢測出霉菌毒素，而2個試驗組在肝腎均檢出有霉菌毒素殘留。與飼料中的毒素含量相比，試驗Ⅰ組3個霉菌毒素在內臟中的殘留分別為20.52%、9.5%和6.03%(肝)；10.40%、23.01%和 4.43%(腎)；飼料中霉菌毒素含量較高的試驗Ⅱ組，其在體內的殘留則高達 18.94%、8.89%和4.50%(肝)；9.47%、21.88%和4.00%(腎)。

2.3 霉菌毒素吸附劑的作用效果

試驗結果表明，霉菌毒素吸附劑均可有效降低肉雞內臟中的霉菌毒素的殘留，與未加吸附劑組比較，飼料中較低含量時，霉菌毒素吸附劑A對試驗肉雞肝腎的霉菌毒素含量分別下降了AFB137.48%、OTA 68.38%和 ZEA 14.3%(肝)；AFB124.90%、OTA 18.73%和ZEA 30.98%(腎)；飼料中含有較高霉菌毒素時，則分別下降了 40.64%、8.74%、15.87%(肝)；30%、37.11%、17.79%(腎)。霉菌毒素吸附劑B的吸附效果明顯高于吸附劑A，添加后，試驗肉雞內臟的霉菌毒素含量下降幅度大幅增大。飼料中較低含量時，分別下降了63.91%、100%和42.06%(肝)；52.14%、46.99%和 64.99%(腎)；飼料中含有較高的霉菌毒素時分別下降了63.72%、32.79%和 39.81%(肝)；52.05%、53.33%和54.34%(腎)。

2.4 吸附劑對霉菌毒素排泄的影響

霉菌毒素吸附劑的作用主要是通過體內對霉菌毒素的吸附，并排出體外。本試驗研究結果表明，飼料添加吸附劑后，試驗組肉雞糞便中的霉菌毒素含量都有不同程度的升高。與未添加組比較，使用吸附劑A后，糞便中的霉菌毒素含量分別為37.77%、33.06%和 38.31%(飼料低含量組)；54.64%、47.80%和44.35%(飼料高含量組)。吸附劑B的吸附效果從糞便中排出的霉菌毒素含量看，也證明其吸附效果高于吸附劑A，與使用吸附劑A比較，排出的霉菌毒素含量分別增加50.22%、20.39%和46.98%(飼料低含量組)；29.20%、17.34%和40.87%(飼料高含量組)。

3 討論與結論

霉菌毒素影響畜禽生長和采食量。本試驗結果證實，肉仔雞在飼喂霉菌毒素后體重顯著下降，料肉比顯著升高，添加霉菌毒素吸附劑后，各項性能指標得到明顯改善。

黃曲霉毒素被動物攝入后，迅速由胃腸道吸收，經門靜脈進入肝臟，在攝食后0.5～1 h，肝內毒素濃度達到最高水平。研究表明動物接觸的日糧中AFB1含量超過20 ng/g，可在肝臟等內臟及畜產品中殘留，其中在肝臟中殘留最多[4]。在有關豬的相關研究中[5]，飼喂含 AFB113.52～80μg/kg的飼料，豬的肝臟、腎臟中 AFB1含量分別為 1.27～1.43 ng/g、2.19～3.44 ng/g。本試驗結果表明，肉雞與豬類似，日糧中的黃曲霉毒素進入肉雞體內后，在肝臟、腎臟中均有一定程度的蓄積，且肝臟中的殘留量高于腎臟，與上述報道一致。國標規定，新鮮豬組織中AFB1的含量不得超過0.5 ng/g，歐盟則不得超過0.05 ng/g。本研究表明，無論低劑量組還是高劑量組的肝、腎中黃曲霉毒素已超標。

已有研究表明，無論飼料中OTA的含量多少，均會轉移到動物源性食品中，特別是是腎臟，一般認為在體內的殘留分布及量為腎臟＞肝臟＞肌肉＞脂肪[6]。即使是被認為健康的屠宰豬，其血液及可食組織中均含有OTA分別為血清2.5～33.3 ng/g，腎臟 1.3～22.0 ng/g，肝臟1.2～19.5 ng/g[7]。本研究結果表明，雞也一樣，即使是低水平的赭曲霉毒素日糧，也會在腎臟及肝臟中殘留，在腎臟中的殘留量高于肝臟。然而目前在國內還沒有規定動物可食組織中OTA的殘留標準。

ZEA通過被污染的谷物和肉、奶等制品進入人體。ZEA及其代謝物主要在肝臟中殘留[8]，James L J等[9]給豬飼喂ZEA污染日糧(40 mg/kg)4周，肝臟中ZEA的濃度為78～128μg/kg。Mirocha C J等[10]報道小雞采食含ZEA 100 mg/kg的日糧8 d，肝臟中ZEA達681μg/kg。本試驗結果顯示，肉雞采食457.7 μg/kg日糧20 d，肝臟中 ZEA含量達18μg/kg，與上述報道相符。然而對于ZEA在動物可食組織中的含量標準不僅在我國甚至在歐盟一些發達國家都沒有作出明確規定。

目前，對飼料中霉菌毒素的控制主要是采用所謂的霉菌毒素吸附劑，盡管品種繁多，但主要成分則是大多為蒙脫石(改性)及酵母細胞壁提取物等。本試驗的吸附劑A的主要成分是純化的鈉化納米蒙脫石，吸附劑B的主要成分是改性蒙脫石及部分酵母細胞壁提取物。關于蒙脫石的理化特性、吸附作用和在畜牧養殖中應用已有許多報道[11－14]。本研究表明，蒙脫石可降低AFB1、OTA、ZEA在肉雞肝臟、腎臟的殘留，提高霉菌毒素的排出率，但作用效果明顯不如改性后的作用效果。對蒙脫石表面基團或電荷分布進行適當改性處理之后，使其表面形成多個不同的結合位點，獲得新的理化特征，大幅度提高吸附能力，不僅提高對AFB1的吸附，同時改善其對ZEA和OTA等極性較低毒素的吸收。

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