β－谷甾醇與γ－谷維素鍵合特征的紅外光譜分析

池建偉 李 陽 張 虹 胡 鵬 傅 紅

(福州大學生物科學與工程學院1，福州 350108)

(豐益(上海)生物技術研發中心有限公司2，上海 200137)

甾醇類化合物在生物體內發揮重要的調節和控制作用，植物甾醇可以抑制以膽固醇為代表的動物甾醇在人體腸腔內的水解和再酯化，并作為競爭者降低飽和脂肪代謝過程中形成的膽固醇數量，從而減少膳食中動物甾醇和飽和脂肪對人體高血脂、糖尿病、心腦血管疾病的不利影響[1－4]。其中，β－谷甾醇和γ－谷維素可以明顯降低血漿中低密度脂蛋白(LDL)及膽固醇量，沒有毒副作用，并且γ－谷維素還具有調節中樞神經以及內分泌等多種生理活性功能[5－10]。因此，它們在許多國家被允許作為新資源食品或食品添加劑[11－13]。

近年的國外研究表明，β－谷甾醇與γ－谷維素的混合物在純油相中可以形成牢固透明的凝膠，甚至在某些條件下形成自組裝的晶體形態[14－17]。按照分子結構形成所需最低能量原則推測，由于β－谷甾醇與γ－谷維素的甾醇單元分別位于結構的一端，而γ－谷維素的阿魏酸位于結構的伸出部位，其輕微的楔形結構為彎曲的超分子結構留下空間[17]，這為β－谷甾醇與γ－谷維素可能通過分子間氫鍵并進一步形成自組裝的晶體狀網絡結構提供了一定的理論依據。但是，至今國內外的研究對晶體結構的形成機理缺乏有效的分析驗證。本試驗建立了傅里葉紅外光譜法表征β－谷甾醇與γ－谷維素氫鍵形成的方法，用偏光顯微鏡下觀察其在油脂體系中的晶體形態，并對其質構特性做了初步的探索。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

β－谷甾醇標準品:上海晶純試劑有限公司；γ－谷維素標準品:日本東京化成工業株式會社；大豆油等植物油脂:嘉里特種油脂(上海)有限公司。

1.2 儀器與設備

BK－POL偏光顯微鏡:奧特光學儀器有限公司；YP802N電子天平:上海精科實業有限公司；尼高力360智能型傅里葉紅外光譜儀:美國尼高力儀器公司；HJ－4A多頭加熱磁力攪拌器:國華儀器有限公司；DC0506W恒溫水浴鍋:上海方瑞儀器有限公司；TA－XT2質構儀:英國 Stable Micro System公司；WZR錐入度:上海精密科學實驗有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的傅里葉紅外光譜分析

1.3.1.1 β－谷甾醇和γ－谷維素樣品準備

將β－谷甾醇標準樣品在150℃下加熱至完全溶解，γ－谷維素標準樣品在170℃下加熱至完全溶解，分別緩慢冷卻至室溫，研磨備用。

1.3.1.2 β－谷甾醇和γ－谷維素物理混合物樣品準備

按照1.3.1.1的方法，分別將研磨好的β－谷甾醇與γ－谷維素進行充分的物理混合，備用。

1.3.1.3 β－谷甾醇和γ－谷維素化合物熔融樣品準備

按一定比例混合β－谷甾醇和γ－谷維素樣品，在170℃下加熱至完全熔融，緩慢冷卻至室溫，備用。

1.3.1.4 傅里葉紅外光譜分析

研磨以上各備用干燥樣品，與200 mg純KBr研細混合至粒度小于2μm，在油壓機上壓成透明薄片，用于傅里葉紅外光譜儀分析。

1.3.2 樣品結晶形態的偏振光顯微鏡分析

1.3.2.1 β－谷甾醇和γ－谷維素的油相樣品

按一定比例混合β－谷甾醇和γ－谷維素的樣品，定量加入植物油脂中，于70℃水浴下溶解，不斷緩慢攪拌成透明黃色，冷卻至室溫，放置在4℃的恒溫培養箱中24 h以上，至結構穩定呈現透明的凝膠狀。

1.3.2.2 樣品晶體形態分析

取適量樣品分別于載玻片上，蓋上蓋玻片，壓成均勻薄片后用連接Canon數碼相機的偏振光顯微鏡觀察樣品的結晶形態，觀察溫度為25℃，顯微鏡放大倍數為200。

1.3.3 質構分析

用質構儀TPA2模式，以直徑為5 mm的探頭(P/5)測樣品硬度值。測試前速度:1.0 mm/s；測試速度:3.0 mm/s；測試后速度:3.0 mm/s；1次距離:10.0 mm；2次距離 10.0 mm；間隔時間:5.00 s。

1.3.4 錐入度值分析

將樣品放于圓形容器內，啟動錐入度計5 s以后，讀取錐入深度值(mm)。

2 結果與討論

2.1 β－谷甾醇與γ－谷維素的鍵合特征分析

通過分子官能團吸收峰的變化特征，紅外光譜法成為表征氫鍵形成效應的有效手段之一。在紅外光譜中，當分子間氫鍵增強時，形成氫鍵的羥基基團的伸縮振動吸收峰將向低波數位移，并導致譜帶變寬[18－19]。

β－谷甾醇和γ－谷維素的分子結構分別如圖1所示，β－谷甾醇以環戊烷全氫菲為骨架(又稱甾核)，分子內有一個羥基基團在箭頭A所指位置上；γ－谷維素是阿魏酸與植物甾醇的結合脂，分子內的羰基在箭頭B所指位置上[14，17]。從氫鍵的形成機理分析，β－谷甾醇可以通過羥基(R—O—H)與γ－谷維素中電負性強的羰基(—C＝O)氧原子，形成分子間氫鍵R—O—H…O—R′。

圖1 β－谷甾醇與γ－谷維素的分子結構式

圖2是β－谷甾醇和γ－谷維素的紅外光譜圖。可見圖2a中β－谷甾醇的—OH伸縮振動的特征吸收峰，其波數在3 440.84 cm－1，圖2b中γ－谷維素的羰基特征伸縮振動的吸收峰在1 710.49 cm－1。

圖2 β－谷甾醇與γ－谷維素紅外光譜圖

分子間氫鍵形成的程度和樣品的濃度有關[15－16]。對比不同配比的β－谷甾醇與γ－谷維素鍵合的紅外光譜，結果如圖3所示。

圖3顯示了不同配比的β－谷甾醇和γ－谷維素化合物的紅外光譜圖，其中β－谷甾醇的—OH伸縮振動峰和γ－谷維素的羰基吸收峰均出現了程度不等的低波數位移，而其他分子官能團特征吸收峰則沒有出現位移。

圖3 不同配比的β－谷甾醇和γ－谷維素化合物的紅外光譜圖

如圖3a和圖3d所示，當β－谷甾醇與γ－谷維素(m/m)1∶4和4∶1時，β－谷甾醇的羥基伸縮振動峰向低波數位移程度較少；當β－谷甾醇與γ－谷維素(m/m)為3∶2時，如圖3c，β－谷甾醇的羥基伸縮振動吸收峰出現明顯的低波數移動，從圖1a的3 440.18 cm－1移到3 301.25 cm－1；尤其在 β－谷甾醇與γ－谷維素(m/m)2:3時，如圖3b所示，β－谷甾醇的羥基伸縮振動峰向低波數移動的程度最大，其紅外吸收峰的波數為3 145.68 cm－1。

從圖3可知，β－谷甾醇的羥基伸縮振動峰向低波數移動，表明β－谷甾醇分子內的羥基和γ－谷維素電負性較強的羰基上氧原子產生了分子間氫鍵；當β－谷甾醇與γ－谷維素的比例不同時，發生的氫鍵效應強弱不同，β－谷甾醇的羥基伸縮振動峰位移程度也不同；當β－谷甾醇與γ－谷維素質量比在2:3時，β－谷甾醇的羥基伸縮振動峰向低波數移動最顯著，暗示此時分子間的氫鍵效應最大。

β－谷甾醇的分子質量為415 u，γ－谷維素的分子質量大約為600 u，當它們配比為2∶3時，β－谷甾醇和γ－谷維素的分子摩爾比大約為1∶1，在此情況下，一分子β－谷甾醇和一分子γ－谷維素可以形成最大氫鍵鍵合比率，氫鍵效應最顯著。

β－谷甾醇與γ－谷維素粉末物理混合物的紅外光譜圖如圖4，和圖3比較，可以看出β－谷甾醇—OH伸縮振動吸收峰與γ－谷維素羰基伸縮振動吸收峰沒有發生位移。由此可以說明，β－谷甾醇與γ－谷維素的氫鍵鍵合紅外圖譜不同于其物理混合物。

圖4 β－谷甾醇與γ－谷維素物理混合物紅外光譜

2.2 β－谷甾醇與γ－谷維素的自組裝體系結晶態特征

將β－谷甾醇、γ－谷維素以及它們的鍵合物，按照相同的添加總量溶解在植物油脂體系中，用偏振光顯微鏡觀察它們所形成晶體的大小和形態，如圖5、圖6所示。

β－谷甾醇在油相中的晶體形態，如圖5a所示，呈現均勻分散、大小一致的長形管束狀，晶體長度約為21.0μm。γ－谷維素在油相中呈透明態，圖5b為其在油相中偏振光顯微鏡圖像，可以看出γ－谷維素完全溶解在油相中，無結晶體產生。

圖5 β－谷甾醇和γ－谷維素在油相中的偏振光顯微鏡圖像

圖6為一系列的β－谷甾醇和γ－谷維素自組裝鍵合物，以不同配比溶解到油相中。從偏光顯微鏡圖像可以看出，它們的結晶形態有明顯的差異。

圖6 不同配比的β－谷甾醇和γ谷維素(m/m)偏振光顯微鏡圖像

當β－谷甾醇和γ谷維素的添加比例為1∶4時，如圖6a所示，油相中只有分布均勻的、極為細小的點狀晶粒，沒有看到其他形態的晶體。這是因為在此體系下，難以獨立成晶的γ谷維素的比例遠高于β－谷甾醇，使油相中β－谷甾醇的分散程度加大，相應減少了β－谷甾醇晶核的聚集和繼續生長，導致油相中的晶體未能成型。

但是，當β－谷甾醇和γ谷維素的添加比例達到2:3時，如圖6b所示，油相中除了有β－谷甾醇結晶體外，還出現了新的晶體形態，并聚集成簇，晶體長度約為20.0μm。不同于圖5a中β－谷甾醇長形、管束狀晶體，新的晶體呈現規則緊密的四瓣形聚集態，形似雛菊，每瓣由3～4個向四周發射的長形管狀構成，晶體中心具有中空的楔形形狀，這種楔形空間，可能更利于彎曲的超分子結構的形成[17]。同時。還可以看出，零星的管束狀β－谷甾醇晶體，分散在成簇的新晶體周圍。這說明β－谷甾醇和γ谷維素通過氫鍵相互吸引，并有規則地組合、排列，構建成一種自組裝的新晶體。

當β－谷甾醇和γ谷維素的添加比例提高到3∶2時，晶體形態如圖6c所示。和圖6b相比，新晶體的聚集程度略有降低，晶體之間的距離變得更大，晶體長度也略有增加，約為23.0μm；同時，油相中分布著更多的管束狀的β－谷甾醇晶體。這意味著β－谷甾醇和γ谷維素鍵合的氫鍵數目減少，導致自組裝的新晶體數量下降，晶體結構開始變得松散。

圖6d是β－谷甾醇和γ谷維素的添加比例高達4∶1時的偏光顯微圖像，油相中只出現了數目極少的、不完全的四瓣形新晶體，大多數是長度約為27.0 μm的、不規則纖維狀結構的β－谷甾醇管狀晶體聚合物。由于β－谷甾醇在油相中可以獨立成晶，因此和圖6a相比，當β－谷甾醇添加比例較大時，更容易形成自組裝新晶體。

以上結果表明，β－谷甾醇和γ谷維素在油相中以分子間氫鍵相互吸引時，可形成自組裝新晶體；晶體的形態和數量隨著β－谷甾醇和γ谷維素的比例，即氫鍵形成的數目而發生明顯的變化。

2.3 質構及錐入度分析

從質構特性分析，β－谷甾醇∶γ－谷維素(m/m)＝2∶3即β－谷甾醇和γ－谷維素形成氫鍵比率最高時，它們在油相中硬度最大，錐入度值最小(圖7)。當 β－谷甾醇∶γ－谷維素(m/m)＝1∶4以及4∶1時，油相體系呈流動狀態，并未檢測到有效數值。這一結果，與紅外光譜分析及偏振光顯微鏡分析一致。

圖7 TPA測試以及錐入度值分析

3 結論

β－谷甾醇上的羥基與γ－谷維素上的羰基可以通過分子間氫鍵進行自組裝，形成新的晶體。從紅外光譜分析可以看出，β－谷甾醇與γ－谷維素發生的氫鍵效應的強弱隨著兩者的比例而不同，當β－谷甾醇和γ－谷維素的比例為2∶3(m/m)，即物質的量比為1∶1時，產生的氫鍵效應最大，其油相體系在偏振光顯微鏡中呈現出規則緊密的四瓣形新晶體，硬度也最大。

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