施用根際有益微生物對盆栽紫花苜蓿土壤中微生物區系的影響

石杰

(黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶 163319)

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一種多年生豆科牧草植物，根狀莖發達，枝葉繁茂，能覆蓋地面、減少蒸發、保蓄水分，減輕地表沖刷。有資料顯示，2～4年生的紫花苜蓿植株每公頃每年可固氮150～450kg，根系腐爛后可增加土壤有機質，改善物理性狀，提高土壤肥力。我國北方干旱地區實行糧食作物與紫花苜蓿輪作，更有利于提高糧食產量［1］。

根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，簡稱PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根際、莖葉的一類可促進植物生長的有益菌類［2，3］。根際有益細菌能夠促進植物對礦質營養的吸收和利用，或者產生促進植物生長的代謝物，甚至抑制有害微生物。固氮菌、解磷細菌、解鉀細菌是具有促進植物生長的PGPR，是微生物肥料的核心，通過代謝可增加土壤中N、P、K及抗菌素、生長素含量，或促進土壤中一些有效性低的營養性物質的轉化，或兼有刺激植物的生長發育進程及防治病蟲害作用。

然而，微生物在根圈的定殖很大程度上依賴于作物根的分泌物和溢出物，因而植物會影響到根圈微生物的群落組成和定殖，而它們特定的分泌物又可以作為化學信號分子而同微生物相互作用。一般而言，土壤以其物化特性和存在的土著微生物群體這兩種方式來影響接種的微生物的定殖。同時，土壤中存在的土著微生物群體可能已經建立了穩定的互作作用，這種互作作用又可能受到接種微生物添加的影響。已有研究表明，植物根圈土壤施入有益微生物后，可促進或抑制某些微生物的生長，調節微生物區系，改善微生態環境，促進植物生長。研究使用根際促生菌增加退化土壤的微生物活性，改變退化土壤的結構組成，達到改良退化土壤的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物

“三得利”為美國引進品種，購買自甘肅省草原總站草業中心(發芽率:85.4%)。

1.1.2 供試菌株

苜蓿根瘤菌菌株91522(Rhizobium meliloti 91522)［4］;

巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium，中國菌保中心菌株號ACCC 10008);

聯合固氮菌(Associative-nitrogen-fixing Bacterium)［5］;

鉀細菌(Bacillus mucilaginosus，膠質芽孢桿菌，西南大學微生物研究中心分離);

纖維素分解菌菌株1306(Cellulose-Degradation Fungi 1306)［6］。

1.1.3 培養基(液)

根瘤菌采用改進的YMA培養基(液)，固氮培養基(液)，硅酸鹽細菌培養基(液)，牛肉膏蛋白胨培養基(液)，察氏培養基(液)，高氏一號培養基。

1.1.4 鈣溶液

使用氯化鈣溶液配制成5mmol/L。

1.1.5 試驗土壤

來源于西南大學水土保持實驗室經水土流失模擬試驗所獲得的土壤，pH7.7，有機質7.27g/kg，全氮0.537g/ kg，全磷0.506mg/kg，全鉀20.4g/kg，堿解氮40.3mg/kg，有效磷6.7mg/kg，速效鉀93.3mg/kg;細菌2.28 E+05 CFU/ gsoil，真菌4.00 E+02 CFU/gsoil，硅酸鹽細菌7.70 E+03 CFU/gsoil，固氮菌2.85 E+03 CFU/gsoil，根瘤菌6.00 E+ 01 CFU/gsoil，放線菌5.90 E+03 CFU/gsoil。

1.2 方法

1.2.1 菌株的準備

取生長于斜面上的苜蓿根瘤菌株91522一支，用5 mL無菌水洗下菌體，取1 mL接種于100 mL中性YMA培養液中，28℃置恒溫震蕩器中培養約24～26 h，調節其OD600值約為1.0后經4000 rpm 20 min收集菌體，重新懸浮于新鮮YMA液體培養基中，加1%羧甲基纖維素納溶液作為黏著劑［7］，用于拌種。將巨大芽孢桿菌，聯合固氮菌，鉀細菌，纖維素分解菌菌株1306活化后培養其相應的菌懸液。接種環接種，培養箱培養至各菌懸液活菌體濃度約為106個/mL。根據田間最大持水量，確定各處理的最大施菌量。

1.2.2 紫花苜蓿種子的制備

挑選均勻飽滿的健壯的苜蓿種子，于50℃～60℃水中浸泡0.5h，撈出，白天放在陽光下曝曬，夜間轉至陰涼處，并加水保持種子濕潤，當大部分種子略有膨脹時用根瘤菌拌種。

1.2.3 土壤性狀測定方法

全氮:蒸餾法;

堿解氮:擴散法;

全磷和有效磷:鉬藍比色法(660 nm比色);

全鉀和有效鉀:火焰光度法(6400型火焰光度計);

有機質:重鉻酸鉀消煮法;

交換性酸:滴定法;

土壤微生物數量:稀釋平板法。

1.2.4 盆栽管理

1)苗期施鈣:苗期施鈣一次，施用5mmol/L CaCl2溶液均勻撒入各個盆栽。

2)栽培管理:取風干土樣過3mm篩，每盆精確裝入6kg土樣，澆透水放置一晚后播種，每盆五穴，每穴播六顆種子。栽培期間澆水、除雜草。待種子均發芽之后按設計方案施入巨大芽孢桿菌、固氮菌、鉀細菌菌懸液。每月同一天取樣一次，取樣后施入相應的新菌懸液，空白處理只澆水。

1.2.5 收后處理

分別于種植紫花苜蓿后的第一個月，第二個月，第三個月和第五個月取土樣，測定其化學和生物變化。第五個月收獲植株，將進入生殖生長的紫花苜蓿植株剪碎，拌入土中、施用相應水平的纖維素分解菌菌懸液，原位土漚熟兩個月，其間定時加水，使土樣保持濕潤，之后，再次取樣進行各個化學和微生物指標的檢測。

1.2.6 試驗因子設計

采用四因素三水平的L9(34)正交設計法(如表1)，四因素分別是施用巨大芽孢桿菌(A)、聯合固氮菌(B)、硅酸鹽細菌(C)和纖維素分解菌(D)，三個水平分別是:水平一是施用該菌株的滅菌的菌懸液15mL、水平二是使用該菌株的活體菌懸液15mL，水平三是使用該菌株的活體菌懸液30mL。共九個處理，重復三次。

表1 正交設計方案L9(34)Tab.1 Orthogonal design L9(34)

1.2.7 數據處理

利用Excel、DPS統計軟件對數據進行統計作圖分析，LSD法作多重比較。

2 結果與分析

2.1 施用固氮菌菌懸液對土壤微生物數量的影響

如表2所示，測定的各個微生物數量指標在每個采樣期均有穩定增加。第一個月中，施用聯合固氮菌菌懸液比不施用對細菌、固氮菌、硅酸鹽細菌數量有顯著增加的作用，其中施用30mL聯合固氮菌的菌懸液對細菌總數的提高影響達到了顯著水平(P＜0.05)，第二個月同樣達到了顯著水平，且比第一個月的細菌總數也有明顯提高，第三個月各個處理的細菌總數基本達到了正常的穩定水平，這說明施用聯合固氮菌對退化土壤的細菌總數具有速效提高的作用。施用纖維素分解菌漚熟兩個月后施用了聯合固氮菌處理的細菌總數還處于兩個月前的水平，而不施用聯合固氮菌的處理則比漚熟前降低了一個多單位，這說明施用聯合固氮菌的菌懸液和滅菌的菌懸液對維持退化土壤的細菌總數的正常水平有重要作用。

表2 施用固氮菌菌懸液對退化土樣微生物數量的影響(logCFU·g-1干土)Tab.2 Effects on the number of microorganism in the degradeted soil after adding Associative-nitrogen-fixing Bacterium(logCFU·g-1dry soil)

2.2 施用巨大芽孢桿菌菌懸液對土壤微生物數量的影響

如表3所示，測定的各個微生物數量指標在每個采樣期均有穩定增加。第一個月中，施用30mL巨大芽孢桿菌菌懸液對細菌總數的提高影響達到了顯著水平(P＜0.05)，施用15mL巨大芽孢桿菌菌懸液對固氮菌、根瘤菌、真菌數量的提高影響達到了顯著水平，施用滅菌的巨大芽孢桿菌菌懸液比活體菌懸液對提高退化土壤硅酸鹽細菌和放線菌的數量更有利。第二個月施用巨大芽孢桿菌菌懸液對各個微生物指標的提高也有顯著作用。其中施用30mL巨大芽孢桿菌菌懸液對退化土壤的細菌總數、固氮菌數量、根瘤菌數量的提高達到了顯著水平，施用15mL巨大芽孢桿菌菌懸液對退化土壤放線菌、真菌數量的提高達到顯著水平。施用滅菌的巨大芽孢桿菌菌懸液對退化土壤的硅酸鹽細菌數量的提高有顯著作用。第三個月各個處理的微生物指標基本達到了正常的穩定水平，這說明施用巨大芽孢桿菌對退化土壤的微生物指標有速效提高的作用。施用纖維素分解菌漚熟兩個月后施用了巨大芽孢桿菌處理的各微生物指標還處于兩個月前的水平，而不施用聯合固氮菌的處理則比漚熟前有所降低，這說明施用巨大芽孢桿菌的菌懸液和滅菌的菌懸液對維持退化土壤的細菌總數的正常水平有重要作用。退化土壤各處理的硅酸鹽數量又降回到原樣的水平。

表3 施用巨大芽孢桿菌菌懸液對退化土樣微生物數量的影響(logCFU·g-1干土)Tab.3 Effects on the number of microorganism in the degradeted soil after adding Bacillus megaterium(logCFU·g-1dry soil)

2.3 施用硅酸鹽細菌菌懸液對土壤微生物數量的影響

如表4所示，測定的各個微生物數量指標在每個采樣期均有穩定增加。第一個月中，施用15mL和30mL硅酸鹽菌懸液對硅酸鹽細菌總數的提高影響達到了顯著水平(P＜0.05)，對其他微生物指標沒有顯著影響。第二個月施用硅酸鹽細菌菌懸液對退化土壤細菌總數、固氮菌數量、根瘤菌數量、真菌數量的提高有顯著作用。第三個月各個處理的微生物指標基本達到了正常的穩定水平，這說明施用硅酸鹽細菌對退化土壤的微生物指標有速效提高的作用。但放線菌和真菌數量在各處理之間有顯著差異。施用纖維素分解菌漚熟兩個月后施用了硅酸鹽細菌處理的個微生物指標還處于兩個月前的水平，而不施用硅酸鹽細菌的處理則比漚熟前有所降低，這說明施用硅酸鹽細菌的菌懸液和滅菌的菌懸液對維持退化土壤的細菌總數的正常水平有重要作用。退化土壤各處理的硅酸鹽數量又降回到原樣的水平。

表4 施用硅酸鹽細菌菌懸液對退化土樣微生物數量的影響(logCFU·g-1干土)Tab.4 Effects on the number of microorganism in the degradeted soil after adding Bacillus mucilaginosus(logCFU·g-1dry soil)

2.4 施用纖維素分解菌菌懸液對土壤微生物數量的影響

使用纖維素分解菌對保持退化土壤的細菌、固氮菌、根瘤菌放線菌和真菌數量有顯著作用。對硅酸鹽細菌數量沒有較大影響(表5)。從表5可以看到固氮菌與纖維素分解菌的相互作用非常顯著，施用15mL纖維素分解菌菌懸液對保持固氮菌和根瘤菌數有顯著作用。

表5 施用纖維素分解菌菌懸液對退化土樣微生物數量的影響(logCFU·g-1干土)Tab.5 Effects on the number of microorganism in the degradeted soil after adding Cellulose-Degradation Fungi(logCFU·g-1dry soil)

2.5 各個微生物指標的相關性研究

對退化土樣中各個微生物指標的相關關系分析表明(表6)，在沙化的退化土壤中固氮菌的數量越多，則細菌總數越多，即細菌總數與固氮菌數量成顯著相關關系，也就是說，促進土壤固氮菌數量的提高有利于土壤中細菌總數的提高。退化土壤中根瘤菌數量與固氮菌數量也有顯著相關的關系，這與兩者的生長基質相似有關。真菌和細菌總數、固氮菌數量和根瘤菌數量有一定的相關，但不顯著。

表6 施入根際有益微生物后退化土壤中各微生物指標的相關關系分析r0.05=0.632Tab.6 Analysis of the correlation among microbial indicators in degradation soil by using PGPR r0.05=0.632

2.6 正交設計直觀分析

如表7，通過對多個響應指標的飽和正交分析，可以看出:能夠提高細菌數量的組合是A1B1C3D2(字母代表因素，數字代表水平)，能夠提高硅酸鹽數量的組合是A3B2C1D1，能夠提高固氮菌數量的組合是A1B2C1D2，能夠提高根瘤菌數量的組合是A2B2C2D3，能夠提高放線菌數量的組合是A2B2C2D1，能夠提高真菌數量的組合是A1B1C1D3。其中A1出現了3回，A2出現了2回，A3出現了1回，B1出現了2回，B2出現了4回，C1出現了3回，C2出現了2回，C3出現了1回，D1出現了2回，D2出現了2回，D3出現了2回。因此，本試驗的主要因素是B，最好的水平是B2。也就是說使用聯合固氮菌對退化土壤各個微生物指標的影響最大，其中施用2.5mL·kg-1的聯合固氮菌的處理對修復退化土壤的微生物區系效果最好。

表7 正交設計直觀分析Tab.7 Analysis of orthogonal design and intuitive

3 結論與討論

對于因水土流失而造成養分流失、沙化和微生物活性下降的退化土壤，種植紫花苜蓿和施用根際有益微生物對退化土壤的微生物數量的提高是非常迅速的，且最后會維持一個動態的平衡，不會因再次加入根際有益微生物而再次增加。但施用的根際有益微生物的種類和數量不同對提高微生物數量的速度和維持退化土壤微生態平衡的力度是不同的。一般施用的根際有益微生物越多，退化土壤的細菌總數也增加得越快。施用30mL聯合固氮菌菌懸液在第一個月基本上就使退化土壤的細菌數量、固氮菌數量、硅酸鹽細菌數量達到最高值。而各個處理的根瘤菌、真菌數量則很快便達到穩定值，甚至不到一個月。各個處理對退化土壤的放線菌數量影響不顯著。空白處理的各個微生物指標雖然隨后也達到了和其他處理相似的水平，但其形成的微生態系統非常容易被破壞，這從漚熟后退化土壤各個處理的微生物數量的變化可以看出。施用15mL巨大芽孢桿菌菌懸液對退化土壤固氮菌數量、根瘤菌數量、真菌數量的迅速提高有顯著作用，施用滅過菌的巨大芽孢桿菌菌懸液對退化土壤的硅酸鹽細菌、放線菌數量的提高有顯著作用。施用15mL硅酸鹽細菌菌懸液可以在第一個月就迅速提高退化土壤的硅酸鹽細菌數量。施用硅酸鹽細菌對其他微生物指標的作用多體現在種植紫花苜蓿兩個月后，一般施用了硅酸鹽細菌的都比空白處理好。漚熟后空白處理的微生物指標多變低較多。施入纖維素分解菌對退化土壤的微生物生態的平衡沒有嚴重的破壞作用。

對土樣中各個微生物指標的相關關系分析表明，土壤中固氮菌的數量越多，則細菌總數越多，即細菌總數與固氮菌數量成顯著相關關系，也就是說，促進土壤固氮菌數量的提高有利于土壤中細菌總數的提高。退化土壤中根瘤菌數量與固氮菌數量也有顯著相關的關系，這與兩者的生長基質相似有關。真菌和細菌總數、固氮菌數量和根瘤菌數量有一定的相關，但不顯著。對本試驗的正交設計的直觀分析表明，在研究中，施用聯合固氮菌對修復退化土樣有著更重要的作用。

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