膽囊癌組織bcl-2和p53基因甲基化水平研究

朝樂孟，李全福

(1.承德醫學院，河北承德 067000;2.內蒙古自治區人民醫院)

膽囊癌組織bcl-2和p53基因甲基化水平研究

朝樂孟1，李全福2△

(1.承德醫學院，河北承德 067000;2.內蒙古自治區人民醫院)

目的:探討膽囊癌組織總甲基化水平、bcl-2和p53基因甲基化水平在膽囊癌發病中的作用。方法:改進的酶聯免疫吸附技術檢測45例膽囊癌組織和40例膽囊炎組織基因組總甲基化水平，應用甲基化特異性PCR技術檢測bcl-2和p53基因甲基化水平，應用熒光RT-PCR技術檢測bcl-2和p53 mRNA的表達。結果:膽囊癌組織基因組總甲基化水平明顯低于膽囊炎，差異具有統計學意義(P＜0.05)。膽囊癌組織p53基因甲基化發生率高于膽囊炎(64.4% vs 17.5%)，差異具有統計學意義(P＜0.05);膽囊癌組織bcl-2基因甲基化發生率與膽囊炎比較差異無統計學意義(17.8% vs 15.0%，P＞0.05)。膽囊癌組織bcl-2 mRNA的表達明顯高于膽囊炎、p53 mRNA的表達明顯低于膽囊炎，差異具有統計學意義(P＜0.05)。結論:基因組總甲基化水平降低和p53高甲基化可能是膽囊癌發生的分子機制之一。

膽囊癌;總甲基化水平;bcl-2;p53;DNA甲基化

膽囊癌(GBC)是一種罕見且惡性程度較高的腫瘤，發病率存在地區和種族差異[1-2]。GBC與慢性膽囊炎(CC)密切相關，所有GBC標本均有炎癥表現,但目前GBC發生的病理生理機制還不清楚[1]。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶作用下通過共價修飾添加一個甲基至DNA雙鏈的胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。在腫瘤的發生中廣泛存在DNA甲基化，一般表現為基因組總甲基化水平降低，癌基因去甲基化表達增加，抑癌基因高甲基化表達降低。bcl-2和p53基因是細胞凋亡途徑的兩個重要因子，bcl-2為癌基因，p53為抑癌基因。目前，有關膽囊癌組織基因組總甲基化水平和bcl-2、p53基因的甲基化水平變化的研究較少，本研究通過研究候選基因的甲基化水平，以期為進一步闡明GBC的病理學機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 2007年至2011年于內蒙古自治區醫院行膽囊切除術的組織病理學標本。45例GBC標本，男11例、女34例，年齡32-89歲，平均62±7.5歲;其中腺癌41例、鱗腺癌3例、鱗癌1例;38例為進展期膽囊癌，浸潤至漿膜層25例(55.6%，25/45)、浸潤漿膜下層13例(28.9%，13/45)，其余7例為早期膽囊癌，僅浸潤至粘膜層或粘膜肌層。40例CC患者，男8例、女32例，年齡33-81歲，平均51±6.8歲。所有標本取出后立即置入液氮中保存。

1.2 檢測膽囊組織基因組總甲基化水平 采用Promega DNA Purification Kit提 取膽囊 組 織基因 組DNA，NanoDrop1000紫外分光光度計檢測基因組DNA濃度，使用Epigentek公司生產的基因組總甲基化定量試劑檢測樣本的基因組總甲基化水平，于波長450nm處讀取吸光度值，計算基因組甲基化水平[公式中的41%是指人類基因組中鳥嘌呤和胞嘧啶(GC)的平均含量]。

1.3 基因組DNA亞硫酸鹽修飾 純化的基因組DNA經NanoDrop1000紫外分光光度計檢測基因組DNA濃度后，使 用ZYMO公 司EZ DNA Methylation-Gold Kit進行DNA亞硫酸鹽修飾。經修飾后的基因組DNA，非甲基化C轉變為U，在PCR反應中擴增為T，而5-mC不變。取基因組DNA 500ng，去離子水稀釋至20μl，加入130μl CT轉化劑，98℃孵育10min、64℃孵育120min后，經脫硫、洗脫、孵育等步驟后每個樣本獲得10μl亞硫酸氫鹽修飾后的基因組DNA，-80℃保存，用于后續PCR反應。

1.4 甲基化特異性PCR(MSP)檢測膽囊組織bcl-2和p53基因甲基化水平 所用引物由Invitrogen公司合成。bcl-2甲基化引物:上游:5’-ATATACGGTTAGAAAGG GTTTAGGC-3’，下游:5’-CCATAAAAACAAAAA CTAA AA AAACG-3’;bcl-2非甲基化引物:上游:5’-ATATG GTTAGAAAGGGTTTAGGTGA-3’，下游:5’-CCATAAA AACAAA AACTAAAAAAACAC-3’，產物長度為156bp。p53基因甲基化引物:上游:5’-TGATTAGGAATTATT GAG AAA TC GA-3’，下游:5’-ACCTCTACCCCCTTTA CTTAACG-3’;p53基因非甲基化引物:上游:5’-TGATT AGGAATTATTG AGAAATTGA-3’，下游:5’-AAACCTC TACCCCCTTTACTTAACA-3’，產物長度172bp。

使用Bio-rad生物MyCyclerTMPCR系統進行擴增，94℃預變性2min，94℃ 30s，67℃(p53 65℃)10s，72℃ 30s，35個循環，72℃ 10min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 RNA提取和熒光RT-PCR Trizol法提取膽囊組織總RNA，NanoDrop1000紫外分光光度計檢測RNA的純度，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，使用Promega公司Universal RiboClone?cDNA Synthesis System逆轉錄為cDNA。bcl-2和p53引物由Invitrogen公司合成，內參基因為GAPDH。引物:bcl-2上游:5’-GGGTGTGAACCACGA GAAAT-3’，下游:5’-ACTGTGGTCATGAGCCACGAGAA AT-3’，產物長度135bp;p53上游:5’-GATTGTGGCCTTCT TTGAGTTC-3’，下游:5’-CGGTTCAGGTACTCAGTCATC T-3’，產物長度111bp。使用美國ABI7500熒光定量PCR儀和Promega公司Access RT-PCR System進行擴增。反應條件:預變性95℃,10min，1個循環;變性95℃，15s;退火60℃，60s;變性和退火40個循環。根據Schmittgen等[3]相對定量法2-△CT公式計算目的基因mRNA的相對表達量。

1.6 統計方法 采用SPSS 17.0統計軟件處理數據，計量資料以(±s)表示、行t檢驗，計數資料行卡方檢驗。

2 結果

2.1 膽囊組織基因組總甲基化水平 CC組織基因組總甲基化水平為(6.278±0.91)%，明顯高于GBC的基因組總甲基化水平(4.87±1.1)%，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 MSP檢測結果 通過甲基化引物(M)和非甲基化引物(U)擴增的PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，只要出現甲基化條帶，即認為發生了甲基化。45例GBC，8例bcl-2基因發生甲基化，發生率17.8%;40例CC，6例bcl-2基因發生甲基化，發生率15.0%;GBC bcl-2甲基化發生率與CC比較無顯著差異(P＞0.05)。45例GBC，29例p53基因發生甲基化，發生率64.4%;40例CC，7例p53基因發生甲基化，發生率17.5%;GBC p53基因甲基化發生率明顯高于CC，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見附圖。

附圖 MSP檢測GBC和CC bcl-2、p53基因甲基化水平(M:甲基化 U:非甲基化，1-4為患者代碼)

2.3 熒 光RT-PCR結 果 GBC bcl-2基 因mRNA表 達水平為(0.66±0.16)，CC bcl-2基因mRNA表達水平為(0.33±0.14)，二者比較差異有統計學意義(P＜0.05)。GBC組織p53基因mRNA表達水平為(0.55±0.17)，CC組織p53基因mRNA表達水平為(0.90±0.10)，二者比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

目前，有關GBC的表觀遺傳學研究相對有限，bcl-2和p53基因甲基化水平的變化在GBC發病中的作用還不清楚。本研究發現，GBC發生過程中，與CC相比，基因組總甲基化水平降低，bcl-2基因甲基化水平無明顯變化，而p53基因甲基化水平明顯升高。

基因組總甲基化水平降低會導致基因組不穩定，從而參與腫瘤形成[4]。本研究發現，GBC基因組總甲基化水平降低。雖然在其它實體腫瘤中，基因組低甲基化是普遍現象，但有關GBC基因組總甲基化水平的報道尚少，本研究進一步證實了這一現象。有研究人員甚至建議，把基因組總甲基化水平作為一種生物學標志物用于腫瘤的篩查、風險評估和預后判斷等[5]。

p53基因是迄今發現的與人類腫瘤相關性最高的基因，具有阻滯細胞周期、抑制細胞增殖、誘導細胞分化、啟動細胞凋亡、維持基因組穩定的作用[6]。Jha等[7]報道，宮頸癌中p53基因表現為高甲基化狀態。本研究亦發現，GBC組織p53高甲基化，p53 mRNA表達降低。高甲基化導致的抑癌基因p53低表達可能是GBC發生的重要機制之一，另外，p53甲基化和p53基因突變是否同時調控，還需進一步驗證。

bcl-2是線粒體放大凋亡途徑的重要調節因子，表達于線粒體外膜，抑制凋亡形成因子從線粒體釋放[8]。bcl-2表達受p53基因調控，上調bcl-2基因表達可抑制細胞凋亡影響細胞周期。Zhu等[9]發現，結腸癌組織bcl-2基因低甲基化，且甲基化與亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)多態性相關。本研究發現，GBC與CC比較，bcl-2甲基化水平無明顯差異，但mRNA表達水平存在差異，表明在GBC的發生中還存在其它調控bcl-2表達的方式，有待于進一步研究。

總之，GBC的發生受遺傳和環境的雙重影響，亦有地域差異，表觀遺傳學調節方式在其發生中具有重要作用，GBC中其它癌基因和抑癌基因的甲基化狀態需進一步探討。

[1]Lazcano-Ponce EC,Miquel JF,Munoz N,et al.Epidemiology and molecular pathology of gallbladder cancer[J].CA Cancer J Clin,2001,51(6):349-364.

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[4]Watanabe Y, Maekawa M. Methylation of DNA in cancer[J].Adv Clin Chem,2010,52(1):145-167.

[5]Kitkumthorn N,Mutirangura A.Long interspersed nuclear element-1 hypomethylation in cancer: biology and clinical applications[J].Clin Epigenetics,2011,2(2):315-330.

[6]Stegh AH.Targeting the p53 signaling pathway in cancer therapy-the promises,challenges and perils[J].Expert Opin Ther Targets,2012,16(1):67-83.

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[8]Low IC, Kang J, Pervaiz S. Bcl-2: a prime regulator of mitochondrial redox metabolism in cancer cells[J].Antioxid Redox Signal,2011,15(12):2975-2987.

[9]Zhu Q,Jin Z,Yuan Y,et al.Impact of MTHFR gene C677T polymorphism on Bcl-2 gene methylation and protein expression in colorectal cancer[J].Scand J Gastroenterol,2011,46(4):436-445.

(基礎醫學欄目編輯:陳志宏)

STUDY ON METHYLATION STATUS OF BCL-2 AND P53 GENE IN GALLBLADDER CARCINOMA

CHAO Le-meng, LI Quan-fu
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the potential role of methylation modif i cation (global DNA methylation, bcl-2/ p53) in gallbladder carcinogenesis.Methods:Innovative enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect global DNA methylation, methylation- specif i c polymerase chain reaction to detect methylation status of bcl-2 and p53, fl uorescent RT-PCR to detect bcl-2 and p53 mRNA expression in 45 cases gallbladder carcinoma and 40 cases chronic cholecystitis.Results:The global DNA methylation status of gallbladder carcinoma was obviously lower than chronic cholecystitis (P＜0.05). The methylation incidence of p53 in gallbladder was signif i cantly higher than chronic cholecystitis (64.4% vs 17.5%, P＜0.05); While, there had no signif i cant differences about methylation incidence of bcl-2 between gallbladder carcinoma and chronic cholecystitis (17.8% vs 15.0%, P＞0.05). bcl-2 mRNA expression in gallbladder carcinoma was obviously higher than chronic cholecystitis, while p53 mRNA expression in gallbladder carcinoma was obviously lower (P＜0.05).Conclusions:Global DNA hypomethylation and p53 hypermethylation may be an important molecular mechanism in gallbladder carcinoma pathogenesis.

Gallbladder carcinoma; Global DNA methylation; Bcl-2; P53; DNA methylation

735.8

A

1004-6879(2013)01-0010-03

2012-08-13)

△ 通訊作者