清開靈注射液對小鼠脾T、B細胞增殖的影響*

邢恩鴻，邵雪齋，王旭丹，王 睿，張 麗△

(1.承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000;2.北京中醫藥大學免疫學教研室;3.北京理工大學)

清開靈注射液對小鼠脾T、B細胞增殖的影響*

邢恩鴻1，邵雪齋1，王旭丹2，王 睿3，張 麗2△

(1.承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000;2.北京中醫藥大學免疫學教研室;3.北京理工大學)

目的:研究清開靈注射液(QKL)在體外對小鼠脾T、B細胞增殖活化的影響。方法:常規制備小鼠脾細胞，觀察T細胞轉化實驗加ConA，觀察B細胞轉化實驗加LPS。采用MTT法觀察不同濃度QKL對小鼠脾T、B細胞增殖活化的作用。結果:不同濃度的QKL(1/3200及以上)對脾B細胞的增殖具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性(P＜0.01)。高濃度QKL(1/400及以上)對脾T細胞增殖具有抑制作用，低濃度QKL(1/800以下)對脾T細胞增殖具有促進作用(P＜0.01)。結論:QKL可通過影響T、B細胞的活化增殖調節機體的免疫反應。

清開靈注射液;脾;T細胞;B細胞;細胞增殖

清開靈注射液(QKL)是在古方“安宮牛黃丸”的基礎上，精選多種中藥研制而成的一種純中藥復方制劑，具有清熱解毒、化痰通絡、鎮驚安神、醒神開竅等功效。在臨床上主要用于治療感染性疾病、腦血管疾病、傳染性疾病和自身免疫性疾病等[1-3]。隨著QKL臨床應用范圍的擴大，有關其治療機制的研究亦日趨深入，但主要集中于腦血管疾病、感染、發熱性疾病等方面，對QKL免疫調節作用機制的研究較少[4-6]。為此，本研究探討了QKL在體外對小鼠脾T、B細胞體外活化、增殖的影響，以期為QKL在臨床上治療免疫相關性疾病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料與試劑 QKL，北京中醫藥大學藥廠;LPS、ConA、甲基偶氮唑鹽(MTT)，美國Sigma公司;RPMI-1640培養液，美國Gibco公司。動物:清潔級雌性C57Bl/6小鼠，體重18-20g，北京維通利華實驗動物中心，合格證號:SCXK(京)2002-0003。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾淋巴細胞懸液的制備:斷頸處死小鼠，無菌分離脾臟，置不完全1640培養液中，用50目鋼網研磨制成單個細胞懸液，1500r/min離心5min，棄上清。沉淀用雙蒸水(低滲法)破壞紅細胞，雙鹽水恢復等滲后，200目尼龍網過濾，1500r/min離心5min后棄上清。收集細胞，冷PBS洗滌2次，用完全1640培養液調整細胞濃度為5×106/ml。

1.2.2 淋巴細胞培養:將密度為5×106/ml的淋巴細胞懸液接種于96孔板，每孔100μl，觀察T細胞轉化實驗加ConA，終濃度為5?g/ml;觀察B細胞轉化實驗加LPS，終濃度為50?g/ml。同時設單純1640培養液細胞對照孔。加入不同稀釋度的QKL，設1/50、1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400八個稀釋度，分別將100?l不同稀釋度的QKL加入板中，每個稀釋度設8個復孔。培養板置于37℃、5% CO2培養箱中孵育72h。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖:培養結束前4h每孔加入MTT溶液20μl后繼續培養，培養結束后培養板3000r/ min離心5min，棄上清，用濾紙吸去水分后，每孔加入酸化異丙醇100μl，靜置15min，輕輕混勻后，492nm波長檢測OD值。

1.3 統計分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

小鼠脾細胞在ConA刺激72h后，OD值為0.405± 0.044，與單純1640培養液(0.073±0.007)比較，脾T細胞明顯增值活化(P＜0.05);LPS刺激72h后，OD值為0.612±0.025，與單純1640培養液(0.125±0.019)比較，小鼠脾B細胞增值活化明顯(P＜0.05)。

QKL對小鼠脾B細胞增殖有明顯的抑制作用，除1/ 6400 QKL與LPS對照比較差異無統計學意義外，從1/3200 QKL即開始顯示出明顯的抑制作用，且呈明顯的劑量依賴性(P＜0.01)。見附表。

QKL對小鼠脾T細胞的增殖表現出高濃度抑制、低濃度促進的作用。QKL稀釋度為1/800到1/3200時，表現出明顯的促T細胞增殖的作用，且呈劑量依賴性(P＜0.01);QKL的濃度增大至1/400以上時，表現出對T細胞增殖明顯的抑制作用(P＜0.01)。見附表。

附表 QKL對小鼠脾T、B細胞增殖的影響(OD值，±s)

附表 QKL對小鼠脾T、B細胞增殖的影響(OD值，±s)

與1640培養液比較:#P＜0.05;與T或B細胞對照比較:P＜0.01

組別 B細胞 (492nm) T細胞(492nm) 1640培養液 0.125±0.019 0.073±0.007 LPS對照 0.612±0.025# -ConA對照 - 0.405±0.044#50-1清開靈 0.137±0.017* 0.078±0.008*100-1清開靈 0.263±0.026* 0.092±0.0007*200-1清開靈 0.474±0.091* 0.174±0.016*400-1清開靈 0.457±0.040* 0.324±0.023*800-1清開靈 0.484±0.038* 0.480±0.037*1600-1清開靈 0.486±0.034* 0.538±0.023*3200-1清開靈 0.519±0.040* 0.520±0.051*6400-1清開靈 0.614±0.034 0.454±0.071

3 討論

T、B細胞是機體執行適應性免疫應答的主要免疫細胞。B細胞不僅能通過產生抗體發揮特異性體液免疫功能，也是重要的抗原提呈細胞。T細胞具有高度異質性，可分為不同的亞群，各亞群之間相互調節，共同發揮免疫功能;T細胞除可介導適應性細胞免疫應答，在胸腺依賴抗原誘導的體液免疫應答中也發揮重要的輔助作用[7]。

免疫應答可分為固有性免疫應答與適應性免疫應答，二者相輔相成、密不可分。適應性免疫是機體對抗內源性與外源性“非己”成分的最終屏障，并且其效應分子可大大促進固有免疫應答，免疫病理及免疫性相關疾病的發生均與適應性免疫應答過程異常有關。適應性免疫應答可分為三個階段:識別階段、活化增殖階段和效應階段。在識別階段，T、B細胞分別通過TCR與BCR精確識別抗原;在活化增殖階段，識別抗原后的淋巴細胞在協同刺激分子的參與下，細胞發生活化、增殖和分化，產生效應細胞、效應分子和記憶細胞;最后是效應階段，效應細胞和效應分子清除抗原。因此，調節T、B細胞的活化增殖可作為理想的免疫干預措施。

本研究應用MTT法觀察QKL在體外對T、B細胞活化增殖的影響。結果顯示，ConA刺激72h、LPS刺激72h，小鼠脾T細胞、B細胞分別明顯增殖活化;加入不同濃度的QKL后，1/3200濃度的QKL對脾B細胞即有明顯的抑制增殖作用，且抑制作用呈明顯的劑量依賴性。有文獻報道，QKL可明顯降低ConA刺激的脾T細胞的增殖指數，且呈一定的濃度依賴性[8]。但本研究發現，高濃度(1/400及以上)QKL對T細胞增殖具有抑制作用，低濃度(1/800及以下)QKL對T細胞增殖具有促進作用。因此表明，QKL是一種有效的免疫調節劑，其治療自身免疫性疾病的機制可能是通過影響T、B細胞的活化增殖調節機體的免疫反應。

[1]傅紅英.清開靈聯合抗生素治療慢性支氣管炎急性發作40例[J].浙江中醫雜志，2010，45(6):423.

[2]陳偉，袁媛，何龍泉，等.清開靈注射液對高血壓腦出血全身炎性反應綜合征的干預作用[J].中醫藥臨床雜志，2005,17(5):463-464.

[3]劉德芳，郭明陽，劉太華，等.注射用清開靈聯合中藥治療類風濕關節炎活動期的臨床研究[J].中國醫院用藥評價與分析，2009，9(1):64-66.

[4]龐春紅，李澎濤，朱曉磊.缺血-再灌注相關細胞因子表達的 TNF -α損傷機制及清開靈的作用[J].世界中醫藥，2011，6(4):343-346.

[5]曹春雨,梁愛華,趙雍，等.清開靈注射液的抗血栓作用及其機制研究[J].中國中藥雜志，2009，34(12):1549-1550.

[6]黃良勝.清開靈注射液解熱抗炎作用的實驗研究[J].臨床合理用藥，2012，5(1C):6-7.

[7]金伯泉，熊思東.醫學免疫學[M].第5版.北京:人民衛生出版社，2009.122-133.

[8]趙令齋，曾耀英，黃秀艷，等.清開靈注射液對小鼠T細胞行為和DTH的影響[J].中山大學學報(醫學科學版)，2008，29(4):407-411.

INFLUENCE OF QINGKAILING INJECTION ON PROLIFERATION OF MOUSE SPLEEN T AND B LYMPHOCYTES

XING En-hong, SHAO Xue-zhai, WANG Xu-dan, et al
(The Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To study the inf l uence of Qingkailing injection (QKL) on proliferation of mouse spleen T and B lymphocytes in vitro.Methods:Concanavalin A was added to mouse spleen lymphocytes to activate T lymphocytes and LPS to activate B lymphocytes. MTT method was used to observe the effects of QKL of different concentration on mouse spleen T and B lymphocytes proliferation.Results:QKL of different concentration (1/3200 and above) could obviously inhibit proliferation of spleen B lymphocytes, and showed dose dependent (P＜0.01). High concentration QKL (1/400 and above) could inhibit proliferation of spleen T lymphocytes, while low concentration QKL (below 1/800) could promote proliferation of spleen T lymphocytes (P＜0.01).Conclusions:QKL can regulate immune reaction by inf l uencing the proliferation of T and B lymphocytes.

Qingkailing injection; Spleen; T lymphocytes; B lymphocytes; Cell proliferation

R285.5

A

1004-6879(2013)01-0003-03

2012-06-10)

* 承德市科技發展計劃項目(200922070)

△ 通訊作者