蘆筍下腳料乙醇提取物免疫功能及活性成分研究

田穎剛，張 盼，黃宇玫，王春艷，朱 勝，喬娟娟，謝明勇,*

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學科學技術學院，江西 南昌 330029)

蘆筍下腳料乙醇提取物免疫功能及活性成分研究

田穎剛1，張 盼1，黃宇玫2，王春艷1，朱 勝1，喬娟娟1，謝明勇1,*

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學科學技術學院，江西 南昌 330029)

用75%乙醇為溶媒，超聲提取蘆筍下腳料，獲得提取物，對提取物中總皂苷、總多糖、總游離氨基酸含量進行分析；用體外細胞培養法觀察該提取物對正常及ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖的影響；以整體口服給藥實驗觀察該提取物對正常小鼠免疫功能的影響，劑量分別為25、100、400mg/(kggd)，連續給藥7d。結果表明：該提取物總皂苷含量高達18.20%、總多糖及總游離氨基酸含量分別為14.86%和12.63%；體外培養對脾淋巴細胞增殖無影響，但對ConA誘導的脾淋巴細胞增殖呈低劑量促進高劑量抑制的作用；口服給藥能增強小鼠碳廓清能力和ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化增殖作用。蘆筍下腳料乙醇提取物具有較明確的增強免疫功能的作用。

蘆筍提取物；皂苷；多糖；游離氨基酸；免疫功能

蘆筍(Asparagus officinalis Linne)又名石刁柏、龍須菜，為百合科多年生草本植物，具有特殊的營養和食療功效，國際市場上享有蔬菜之王的美稱[1]。蘆筍含有多種活性成分，如蘆筍多糖[2]、皂苷類化合物[3-4]、氨基酸[5]及黃酮類物質[6]等，具有抗腫瘤[7]、抗炎[8]、抗衰老[9]、免疫調節[10]等多種生物學功能。

近年來蘆筍產業在我國迅猛發展，已成為世界上第一大蘆筍生產國和出口國。目前我國蘆筍除了供新鮮食用外，主要用于加工蘆筍罐頭和速凍產品，在加工過程中，每年產生大量的老莖和蘆筍皮等下腳料。隨著蘆筍的大量種植，越來越多的蘆筍下腳料如果不進行加工利用，任其自然腐敗，既污染環境，又造成資源的浪費。有報道[11]稱，這些下腳料中富含營養和功能活性成分，如：風干蘆筍根中甾體皂苷元含量在1.2%以上；蘆筍罐頭下腳料中18種氨基酸含量達0.73%，必需氨基酸占總氨基酸的32.92%，粗多糖含量為0.41%[12]。為了使蘆筍下腳料得到充分的利用，使之變廢為寶，本實驗采用75%乙醇從蘆筍下腳料獲得提取物，并對總皂苷、總多糖及總游離氨基酸含量進行分析，采用體外細胞培養及整體動物實驗，分析蘆筍醇提物對機體免疫功能的影響，為充分利用蘆筍資源及延伸蘆筍產業提供一定的理論依據和參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

實驗動物：雄性Balb/C小鼠，體質量18～22g，購自南昌大學醫學院實驗動物中心。

蘆筍下腳料為田間采收的綠蘆筍嫩莖，經整理切割后，不作商品蘆筍使用的剩余物，秦皇島長勝農業科技發展有限公司提供(采收時間，2011年5月)，新鮮樣品干燥后粉碎至20目備用；人參總皂苷(總皂苷含量＞95%)南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室自制。

菝葜皂苷元標準品、葡萄糖標準品、天冬氨酸標準品 中國藥品生物制品檢定所；RPMI1640細胞培養液北京索萊寶科技有限公司；新生牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；刀豆蛋白A(ConA)、噻唑藍(MTT) 美國Sigma公司；印度墨水 北京索萊寶科技有限公司；24、96孔細胞培養板(平底) 美國Costor公司。

1.2 儀器與設備

MK3酶標儀 上海熱電儀器有限公司；IDX-35B型高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；超凈工作臺 廈門精藝興業有限公司；KQ3200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SENCO R系列旋轉蒸發器 上海申生科技有限公司；BDS200倒置顯微鏡 北京福凱儀器有限公司；WJ-80A-111二氧化碳培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；UV2800紫外-可見分光光度計尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆筍下腳料乙醇提取物的制備

稱取60℃真空干燥至質量恒定的蘆筍下腳料5g，以50mL 75%乙醇60℃超聲回流30min，超聲功率為150W。過濾取濾液，重復此步驟3次，濃縮、真空干燥至質量恒定，得蘆筍乙醇提取物(得率約為31%)。

1.3.2 蘆筍下腳料乙醇提取物的成分分析

蘆筍乙醇提取物中總皂苷含量的測定采用香草醛-高氯酸法[13]：精確吸取各質量濃度菝葜皂苷元標準品甲醇溶液(0、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4mg/mL)0.5mL，70℃水浴揮干溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，搖勻密封，于70℃水浴15min，取出，立即用冷水冷卻，加入5mL的冰乙酸，搖勻，反應5min，以溶劑作空白，于波長535nm處測吸光度，以吸光度(A)對菝葜皂苷元質量濃度(ρ)繪制標準曲線。稱取0.40mg干燥至質量恒定的蘆筍乙醇提取物溶解于10mL甲醇中，按上述步驟操作。根據標準曲線計算提取物中的總皂苷含量。

總多糖含量采用蒽酮-硫酸法測定[14]：精密量取不同質量濃度葡萄糖對照品水溶液(0、0.018、0.036、0.054、0.09、0.108mg/mL)各1.0mL于10mL玻璃離心管中，分別加入0.2%蒽酮-硫酸試劑4mL，混勻，立即置冰水浴中冷卻5min，取出后置沸水浴中加熱10min，取出，置冷水流中冷卻至室溫。以溶劑為空白，于波長626nm處測定吸收度，以吸光度(A)對葡萄糖質量濃度(ρ)繪制標準曲線。稱取0.40mg干燥至質量恒定的蘆筍乙醇提取物溶解于10mL蒸餾水中，按上述步驟操作。根據標準曲線計算提取物中的總多糖含量。

總游離氨基酸采用茚三酮法測定[15]：分別精密量取不同質量濃度天冬氨酸標準品水溶液(0、0.015、0.03、0.045、0.09 mg/mL)各1.0mL于10mL量瓶中，分別加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)2mL和3%茚三酮70%乙醇溶液1mL，混勻，沸水浴加熱15min，取出，冷卻至室溫，加水定容至刻度，搖勻。以溶劑為空白，在570nm波長處測定吸收度，以吸光度(A)對天冬氨酸質量濃度(ρ)繪制標準曲線。稱取0.40mg干燥至質量恒定的蘆筍乙醇提取物溶解于10mL蒸餾水中，按上述步驟操作。根據標準曲線計算提取物中的總游離氨基酸含量。

1.3.3 實驗分組及劑量設置

取Balb/C小鼠，按體質量隨機分為5組(每組小鼠15只)，分別灌服蘆筍乙醇提取物低、中、高劑量水溶液、生理鹽水及人參皂苷水溶液。蘆筍提取物低、中、高劑量分別按25、100、400(kggd)灌胃，人參皂苷(陽性對照)按12.5mg/kg灌胃，空白對照組灌服同體積生理鹽水。每日給藥1次，連續7d。

1.3.4 小鼠免疫器官指數測定

各實驗組小鼠末次灌胃給藥后，禁食12h，每組小鼠15只。稱質量，頸椎脫臼處死，取其脾臟及胸腺稱質量，計算脾臟指數(脾臟質量/體質量)及胸腺指數(胸腺質量/體質量)。

1.3.5 蘆筍乙醇提取物對體外培養的小鼠脾淋巴細胞的影響

1.3.5.1 脾細胞懸液的制備

小鼠無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經200目篩網過濾，用Hank’s液洗2次，每次離心5min(1000r/min)。棄上清，加3mL Tris-NH4Cl紅細胞裂解液輕輕吹勻，以1000r/min離心5min，棄上清。如仍有紅細胞重復此操作。然后將細胞懸浮于1mL的完全培養液中，用臺盼藍染色計數活細胞數(應在95%以上)，調整細胞濃度為3h106個/mL。

1.3.5.2 蘆筍乙醇提取物對體外培養的正常及ConA誘導脾淋巴細胞轉化增殖的影響

取24孔細胞培養板，每孔加0.5mL脾細胞懸液，另依次加入0.5mL的含不同終質量濃度蘆筍提取物(0、1、5、20、100、500、1100、2200μg/mL)的RPMI 1640完全培養液，每孔設6個復孔，其中3復孔每孔加入75μL ConA液(相當于7.5μg/mL)，其余各孔加等量的完全培養液。置5% CO2，37℃ CO2孵箱中培養72h。培養結束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培養液，同時加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，繼續培養4h。培養結束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養板中，每個孔分裝4孔作為平行樣，用酶聯免疫檢測儀，于490nm波長測定光密度值。

1.3.6 蘆筍乙醇提取物口服給藥對小鼠脾淋巴細胞轉化增殖的影響

各實驗組小鼠末次灌胃給藥30min后，分別無菌取脾，每組小鼠15只。按1.3.5節方法制備單細胞懸液。以每孔1mL細胞懸液加入24孔培養板中，每樣本設2復孔加75μL ConA液(相當于7.5μg/mL)，另兩復孔加等量RPMI 1640完全培養液作為對照，置5% CO2，37℃二氧化碳孵箱中培養72h。MTT檢測方法同上。按式(1)計算脾淋巴細胞刺激指數(SI)[16]。

式中：OD1為ConA誘導的脾淋巴細胞光密度；OD2為不加ConA的脾淋巴細胞光密度。

1.3.7 小鼠碳廓清實驗

各實驗組小鼠末次灌胃給藥30min后，稱體質量，每組小鼠15只。從小鼠尾靜脈注入稀釋6倍的印度墨汁，按每10g體質量0.1mL計。待墨汁注入，立即計時。注入墨汁后3、11min，分別從內眥靜脈叢取血20μL，并立即將其加到 2mL 0.1g/100mL Na2CO3溶液中。用分光光度計于600nm波長處測光密度，以Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱質量。

以吞噬指數表示小鼠碳廓清的能力。按式(2)、(3)計算吞噬指數α。

式中：OD1為注射墨水3min的光密度值；OD2為注射墨水11min的光密度值；t1為注射墨水后第1次取血時間即3min；t2為注射墨水后第2次取血時間即11min。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 蘆筍下腳料乙醇提取物的成分分析

由表1可以看出，蘆筍下腳料經乙醇提取后，富含皂苷、多糖、總游離氨基酸等活性成分，其中蘆筍總皂苷含量高達18.20%，表明乙醇提取能較好地富集蘆筍活性成分。

表 1 蘆筍乙醇提取物中活性成分含量(x±s,n＝3)Table 1 Active components in ethanol extract from asparagus scraps (x±s,n＝3)

2.2 蘆筍乙醇提取物對小鼠免疫器官的影響

表 2 蘆筍乙醇提取物對小鼠脾臟指數和胸腺指數的影響(±s,n＝3)Table 2 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on spleen index and thymus index in mice (±s,n＝3)

表 2 蘆筍乙醇提取物對小鼠脾臟指數和胸腺指數的影響(±s,n＝3)Table 2 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on spleen index and thymus index in mice (±s,n＝3)

注：*.與空白對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與空白對照組相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

2.47f0.85 3.33f0.86* 3.09f0.60* 3.35f0.60** 3.32f0.74*組別劑量/(mg/(kggd))體質量/g脾臟指數胸腺指數空白對照組蘆筍乙醇提取物低劑量組蘆筍乙醇提取物中劑量組蘆筍乙醇提取物高劑量組陽性對照組25 100 400 12.5 24.96f2.87 23.34f3.30 24.57f1.07 26.71f1.89 26.08f1.90 4.67f0.87 5.63f1.30* 5.50f0.94* 6.53f0.94** 5.95f1.13**

表2顯示，蘆筍乙醇提取物各劑量組及陽性(人參皂苷)對照組小鼠連續灌服蘆筍乙醇提取物7d，體質量與空白對照組相比無顯著差異，提示該蘆筍乙醇提取物對小鼠體質量無影響。

與空白對照組相比，蘆筍乙醇提取物低、中劑量組的脾臟指數及胸腺指數及人參皂苷組的胸腺指數有顯著性差異(P＜0.05)，高劑量組的脾臟指數及胸腺指數及陽性對照組的脾臟指數有極顯著差異(P＜0.01)，表明蘆筍乙醇提取物和人參皂苷均可以增強實驗小鼠脾臟指數及胸腺指數，且蘆筍乙醇提取物有隨劑量增加而增大的趨勢。

2.3 蘆筍乙醇提取物對體外培養的小鼠脾淋巴細胞轉化增殖的影響

脾臟是機體內最大的外周免疫器官，也是T/B淋巴細胞定居和接受抗原刺激產生免疫應答的重要場所。T淋巴細胞是介導機體細胞免疫的重要細胞，ConA等有絲分裂原能非特異性地誘導 T 細胞活化，導致細胞因子合成及細胞因子受體表達?？沙霈F細胞體積增大，代謝旺盛，蛋白與核酸合成增加，并進行分裂增殖。根據T淋巴細胞轉化增殖程度，可反映機體細胞免疫水平。

圖1顯示，蘆筍乙醇提取物各質量濃度條件下的體外培養的正常的脾淋巴細胞OD490nm值相近且與空白對照組相同，表明蘆筍乙醇提取物對體外培養的正常的脾淋巴細胞轉化增殖無促進和抑制作用，而加ConA誘導以后，各藥物質量濃度及對照組脾淋巴細胞OD490nm值較不加ConA誘導組皆明顯升高，且隨蘆筍乙醇提取物劑量的升高其OD490nm值逐漸下降，當蘆筍乙醇提取物質量濃度≥500μg/mL時，呈顯著性差異(P＜0.05)，表明蘆筍乙醇提取物對ConA誘導的脾淋巴細胞轉化增殖呈低質量濃度促進，高質量濃度抑制的雙向調節作用。

圖 1 蘆筍乙醇提取物對體外培養的脾淋巴細胞的影響(x±s)Fig.1 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on the proliferation of spleen lymphocytes in vitro(x±s)

2.4 不同劑量蘆筍乙醇提取物口服給藥對小鼠脾淋巴細胞轉化增殖的的影響

表 3 蘆筍乙醇提取物對小鼠脾淋巴細胞轉化增殖能力的影響(±s,n＝3)Table 3 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on the proliferation of spleen lymphocytes in mice (±s, n＝3)

表 3 蘆筍乙醇提取物對小鼠脾淋巴細胞轉化增殖能力的影響(±s,n＝3)Table 3 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on the proliferation of spleen lymphocytes in mice (±s, n＝3)

組別劑量/(mg/(kggd))脾淋巴細胞刺激指數(SI)空白對照組蘆筍乙醇提取物低劑量組蘆筍乙醇提取物中劑量組蘆筍乙醇提取物高劑量組陽性對照組25 100 400 12.5 2.309f0.459 3.195f1.123* 3.307f0.976** 3.670f1.781* 3.204f1.312*

表3顯示，蘆筍乙醇提取物低、高劑量組及陽性對照組(人參皂苷)淋巴細胞轉化增殖能力與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，中劑量組有極顯著差異(P＜0.01)，表明蘆筍乙醇提取物可以增強刀豆蛋白誘導的小鼠脾淋巴細胞的轉化增殖，具有提高細胞免疫的功能。整體實驗藥物經口服進入機體后，受體內完整統一的內環境、各種神經體液調節相互作用，而體外實驗藥物直接作用于細胞，失去了及各種組織與細胞的相互作用及體內各種復雜因素干擾，所以體外實驗中藥物對細胞影響更為單一和顯著，由圖1和表3可以看出，蘆筍乙醇提取物對整體及體外實驗中ConA誘導的脾淋巴細胞增殖的影響具有一定的吻合性，即兩者都有最合適的轉化增殖有效濃度，并非劑量越大轉化增殖效果越顯著。

2.5 蘆筍乙醇提取物對小鼠碳廓清能力的影響

表 4 蘆筍乙醇提取物對小鼠碳廓清能力的影響(±s, n＝3)Table 4 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on carbon clearance index in mice±s, n＝3)

表 4 蘆筍乙醇提取物對小鼠碳廓清能力的影響(±s, n＝3)Table 4 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on carbon clearance index in mice±s, n＝3)

組別劑量/(mg/(kggd))吞噬指數(α)空白對照組蘆筍乙醇提取物低劑量組蘆筍乙醇提取物中劑量組蘆筍乙醇提取物高劑量組陽性對照組25 100 400 12.5 4.499f0.783 5.723f0.875** 5.312f0.854* 5.074f0.645 5.318f0.982*

由表4可見，與空白對照組相比，蘆筍乙醇提取物低劑量組的吞噬指數有極顯著性差異(P＜0.01)，中劑量組有顯著性差異(P＜0.05)，蘆筍乙醇提取物高劑量組雖有增強趨勢，但無統計學差異(P＞0.05)，陽性對照組有顯著的差異。提示蘆筍乙醇提取物在一定有效劑量前提下，具有增強單核-巨噬細胞吞噬功能的作用，但隨劑量增加，有作用減弱的趨勢。

蘆筍乙醇提取物對小鼠脾淋巴細胞增殖及碳廓清能力調節效應的劑量關系，為蘆筍下腳料提取物及蘆筍下腳料的深入開發利用提供了一定的實驗基礎，在開發相關產品時要注意蘆筍提取物的添加使用量并非越多越好。

3 結 論

本實驗采用乙醇對蘆筍下腳料進行提取，制備得到的乙醇提取物中皂苷含量為18.20%、多糖含量為14.86%及總游離氨基酸含量為12.63%，說明采用乙醇提取可較好地富集蘆筍下腳料中活性物質。體外實驗表明該提取物對脾淋巴細胞增殖無影響，但對ConA誘導的脾淋巴細胞增殖呈低劑量促進、高劑量抑制的作用，整體實驗顯示該提取物明顯提高ConA誘導脾淋巴細胞轉化增殖作用，顯著增強小鼠碳廓清能力，使細胞和體液免疫能力加強，具有提高和調節免疫功能的作用。綜上所述，本實驗制備獲得的蘆筍下腳料乙醇提取物具有較高應用價值。

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Immunoregulatory Functions and Active Components of Ethanol Extract from Asparagus Scraps

TIAN Ying-gang1，ZHANG Pan1，HUANG Yu-mei2，WANG Chun-yan1，ZHU Sheng1，QIAO Juan-juan1， XIE Ming-yong1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. College of Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330029, China)

In this study, 75% ethanol extract from asparagus scraps obtained by ultrasonic-assisted extraction was analyzed for the contents of total saponins, total polysaccharides and free amino acids. Meanwhile, its in vitro effect on the normal and Con A-induced proliferation of mouse spleen lymphocytes was studied, and the effect of oral administration at doses of 25, 100 mg/kg and 400 mg/kg on immune functions in normal mice was also observed. The ethanol extract contained 18.20% total saponins, 14.86% total polysaccharides and 12.63% free amino acids. It had no inf l uence on normal spleen lymphocytes in vitro, whereas the ConA-induced proliferation of spleen lymphocytes could be promoted at 25 mg/kg but suppressed at 400 mg/kg by it. Oral administration of this extract enhanced carbon clearance capacity in mice and the ConA-induced proliferation of spleen lymphocytes. Therefore, this asparagus extract has remarkable immunoenhancing functions.

asparagus extract；saponin；polysaccharide；free amino acid；immune function

TS201.4

A

1002-6630(2013)01-0277-04

2011-11-08

國家公益性行業(農業)科研專項(201003074-5)

田穎剛(1972ü)，男，副研究員，博士，研究方向為食品化學與營養。E-mail： tianyinggang@yahoo.cn

*通信作者：謝明勇(1957ü)，男，教授，博士，研究方向為食品化學、食品營養與安全。E-mail： myxie@ncu.edu.cn