紫外線與N+注入復(fù)合誘變選育曲酸高產(chǎn)菌株

凌 帥，劉 詠,*，姚建銘，李 俊

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230031)

曲酸是一種重要的有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于化妝品[1]、食品加工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)[2]等領(lǐng)域。特別是在食品加工領(lǐng)域，由于其安全無毒，作為理想的多酚氧化酶抑制劑[3]，最具應(yīng)用前景。據(jù)統(tǒng)計，曲酸國際市場需求量在500～600t/a，國內(nèi)市場估計在2a內(nèi)需求可達(dá)40～50t。國內(nèi)外需求量的增加，勢必給曲酸的研究帶來更大的動力。目前曲酸的生產(chǎn)以微生物的發(fā)酵為主，為了能夠滿足國內(nèi)外的需求，提高發(fā)酵菌種的產(chǎn)酸量將會是研究的重點，很多學(xué)者致力于提高曲酸產(chǎn)量的研究已經(jīng)取得了不少成果。例如李鳳玲等[4]采用單因子的紫外誘變對米曲霉NKS-145進(jìn)行誘變，曲酸產(chǎn)量最高為8g/L；李一婧等[5]采用紫外線對米曲霉2337進(jìn)行多次的重復(fù)誘變，曲酸最終產(chǎn)量最高為18.13g/L?？梢钥闯鰝鹘y(tǒng)的誘變方法不能達(dá)到理想的效果。

離子注入技術(shù)是集化學(xué)誘變、物理誘變?yōu)橐惑w的綜合誘變方法，可使遺傳物質(zhì)在基因水平或分子水平上發(fā)生改變或缺失，顯著提高生物的變異率，獲得損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定的誘變效果[6-7]。已被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)作物、微生物育種和轉(zhuǎn)基因[8-10]，在微生物育種方面，已經(jīng)應(yīng)用于枯草桿菌[11]、α-淀粉酶生產(chǎn)菌[12]、檸檬酸[13]生產(chǎn)菌等諸多菌種的誘變，并且均獲得了理想的誘變效果。本實驗以安徽科聚環(huán)保新能源有限公司實驗室原有米曲霉菌株為出發(fā)菌株，以紫外誘變和氮離子注入誘變的復(fù)合誘變選育，篩選出產(chǎn)曲酸水平高的菌種。

1 材料與方法

1.1 菌種

滬釀3.042、渝3.811、AS3.866、CICC-2336、CICC-2337共5種米曲霉菌種，由安徽科聚環(huán)保新能源有限公司實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

斜面PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200、蔗糖20、瓊脂20，pH值自然；30℃恒溫培養(yǎng)72h。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100、玉米粉20、酵母膏10、KH2PO45、MgSO4·7H2O 2.5，pH值自然；250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基50mL，接一環(huán)菌種孢子于培養(yǎng)基中，30℃恒溫，搖床180r/min培養(yǎng)24h，作為一級種子。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100、酵母膏2.5、K2HPO41、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5，pH值自然；500mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基85mL，吸取15mL一級種子液，即接種量為15%，30℃恒溫，搖床180r/min培養(yǎng)7d。

篩選培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基+20g/L瓊脂+0.5g/L曲拉通+10g/L FeCl3-HCl顯色劑，pH值自然；30℃恒溫培養(yǎng)72h。

1.3 出發(fā)菌株的篩選

選擇本實驗室現(xiàn)有產(chǎn)曲酸的5個菌種：滬釀3.042、渝3.811、AS3.866、CICC-2336、CICC-2337，利用Fe3+與曲酸絡(luò)合反應(yīng)可生成紅色物質(zhì)的特性，搖瓶發(fā)酵，取發(fā)酵上清液采用三氯化鐵比色法選出曲酸產(chǎn)量最高的菌株，作為實驗的出發(fā)菌株。

1.4 菌種誘變

1.4.1 誘變的流程

1.4.2 孢子懸浮液的制備[14]

取新鮮的斜面菌種，用加入0.5g/L曲拉通的無菌水洗下，經(jīng)過玻璃珠打散，制備成含孢子1×106個/mL懸浮液。放入培養(yǎng)箱中30℃萌發(fā)12h。

1.4.3 UV誘變[15-16]

各取5mL萌發(fā)12h后的米曲霉2336孢子懸浮液于6塊無菌培養(yǎng)皿中，將其中5塊放入帶有磁力攪拌器的暗箱中，15W、30cm振蕩進(jìn)行紫外照射，分別照射20、40、60、80、100s，未經(jīng)過紫外照射的培養(yǎng)皿作為對照。照射完后將所有培養(yǎng)皿放入黑暗處2h。

1.4.4 亞硝酸鹽誘變

分別取萌發(fā)12h的UV7孢子懸浮液1mL、pH4.5醋酸緩沖液2mL以及0.1mol/L亞硝酸鈉溶液1mL于4支無菌試管中，于25～26℃分別保溫5、10、15、20min，再加入0.07mol/L pH8.6的磷酸氫二鈉溶液20mL終止反應(yīng)。以加入UV7孢子懸浮液1mL和23mL無菌水的試管為對照。

1.4.5 氮離子注入誘變[17-18]

各取0.1mL萌發(fā)12h后的UV7孢子懸浮液，均勻涂布于6塊無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于超凈工作臺上，待無菌風(fēng)將平板表面的水跡吹干后對其中5塊板進(jìn)行注入。離子注入機(jī)是由中國科學(xué)研究院離子束生物工程重點實驗室研究制備的。在注入機(jī)上，以10keV的注入能量分別對孢子液進(jìn)行5×1014、10×1014、15×1014、20×1014、25×1014ions/(cm2·s)不同劑量的注入；注入靶室的真空度為10-3Pa。將以同樣方法涂布吹干后但未經(jīng)過離子注入的樣品作為對照。注入完成后立即在超凈工作臺上用新鮮無菌水洗脫所有培養(yǎng)皿上的孢子。

1.4.6 高產(chǎn)菌株的篩選

初篩：取經(jīng)過誘變處理后的孢子液，適當(dāng)稀釋后涂布于篩選顯色板上，放入培養(yǎng)箱中30℃黑暗培養(yǎng)，3d后進(jìn)行觀察，挑選出最先出現(xiàn)紅色與紅色較深的單菌落，保存于斜面培養(yǎng)基上；復(fù)篩：取經(jīng)過初篩選出的斜面菌種，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、搖床180r/min發(fā)酵培養(yǎng)7d后，采用三氯化鐵比色法測定發(fā)酵上清液曲酸含量，與對照菌株的曲酸產(chǎn)量相比，進(jìn)行復(fù)篩。

1.5 菌種生長曲線的測定

從發(fā)酵第2天開始，每天取發(fā)酵液100mL，4500r/min離心，上清液采用三氯化鐵比色法測定曲酸含量，菌絲體105℃烘干至質(zhì)量恒定，測定生物量。連續(xù)取樣至發(fā)酵第10天。

1.6 突變菌株傳代實驗

為了確定經(jīng)過復(fù)合誘變而得到的高產(chǎn)菌株產(chǎn)酸能力是否穩(wěn)定。對經(jīng)過不同復(fù)合誘變得到的菌種進(jìn)行傳代產(chǎn)酸性能實驗。經(jīng)過一級種子液，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，按照15%接種量，30℃恒溫，搖床180r/min的發(fā)酵條件培養(yǎng)7d后測定發(fā)酵上清液中曲酸含量。每次傳代發(fā)酵都做平行實驗。

1.7 指標(biāo)測定

曲酸含量的測定：三氯化鐵比色法[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的篩選

對滬釀3.042、渝3.811、AS3.866、CICC-2336、CICC-2337這5株菌種進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示CICC-2336與Fe3+反應(yīng)產(chǎn)生的顏色最深，并且采用三氯化鐵比色法測出的曲酸含量也是最高。最終選擇出CICC-2336為實驗出發(fā)菌株，原始產(chǎn)酸量為12g/L，結(jié)果見圖1。

圖 1 出發(fā)菌株選育結(jié)果Fig.1 Screening of starting strain for mutation breeding

2.2 誘變結(jié)果與分析

2.2.1 顯色篩選板

根據(jù)曲酸與Fe3+發(fā)生螯合反應(yīng)，產(chǎn)生紅色物質(zhì)的原理。由圖2可知，3d后對篩選板上的單菌落進(jìn)行篩選，挑選出最先出現(xiàn)紅色與紅色較深的單菌落保存于斜面培養(yǎng)基上。

圖 2 培養(yǎng)3d后的顯色板Fig.2 Colony formation after 3 days of culture on chromogenic medium

2.2.2 紫外(UV)誘變存活率及選育結(jié)果

圖 3 UV誘變存活率曲線Fig.3 Survival rate of Aspergillus oryzae CICC-2336 after exposure to UV

由圖3可知，隨著照射時間的增加，菌株的存活率逐漸下降，照射時間為100s時，菌株幾乎無存活，這樣將很難選育到優(yōu)良的菌株。一般采用存活率在20%左右的誘變劑量。因此，最適的誘變劑量為距離15W紫外燈30cm處照射40s，此時的存活率為21.02%。圖4顯示，經(jīng)過搖瓶復(fù)篩選育出一株編號UV7的突變菌株，其產(chǎn)酸量為18.50g/L。與原始菌株2336相比產(chǎn)酸量提高54.17%。

圖 4 UV誘變選育結(jié)果Fig.4 Kojic acid production of UV-induced mutant strains

2.2.3 亞硝酸鹽(NV)誘變的存活率及選育結(jié)果

由圖5可知，隨著誘變時間的增加，菌株的存活率逐漸下降，誘變時間為15min時，菌株幾乎已無存活，這樣將很難選育到優(yōu)良的菌株。一般采用存活率在20%左右的誘變劑量。因此，最適的誘變時間為5min，此時的存活率為24.23%。圖6顯示，經(jīng)過搖瓶復(fù)篩選育出一株編號NV3的突變菌株，其產(chǎn)酸量為23.58g/L。與原始菌株2336相比產(chǎn)酸量12g/L提高96.50%，與UV7菌株產(chǎn)酸量18.50g/L相比，提高27.46%。

圖 5 亞硝酸鹽誘變存活率曲線Fig.5 Survival rate of Aspergillus oryzae CICC-2336 after nitrite treatment

圖 6 亞硝酸鹽(NV)誘變選育結(jié)果Fig.6 Kojic acid production of nitrite-induced mutant strains

2.2.4 N+注入誘變存活率及選育結(jié)果

圖 7 注入能量為10 keV N+注入存活率曲線Fig.7 Survival rate of Aspergillus oryzae CICC-2336 after N+implantation (10 keV)

圖 8 N+誘變選育結(jié)果Fig.8 Kojic acid production of N+ implantation-induced mutant strains

由圖7可知，隨氮離子注入劑量的增加，菌株存活率曲線呈現(xiàn)較明顯的先降后升再降的“馬鞍型”變化。在注入劑量為5×1014ions/(cm2·s)時，菌株的存活率為

42.12%，當(dāng)注入劑量為10×1014ions/(cm2·s)時，存活率下降到22.87%，但是注入劑量達(dá)到15×1014ions/(cm2·s)時，菌株存活率反而提高到29.12%，接著增大注入劑量到20×1014ions/(cm2·s)時，存活率又降低到12.43%。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是低劑量注入時，離子對細(xì)胞表面進(jìn)行損傷和刻蝕，因而存活率較高。隨著劑量的增加，細(xì)胞表面刻蝕嚴(yán)重，離子損及細(xì)胞內(nèi)部并產(chǎn)生大量自由基和軟射線等，致使存活率急劇下降；繼續(xù)加大劑量，細(xì)胞某種修復(fù)機(jī)制和修復(fù)酶被激活，存活率又有所回升。本實驗選用10×1014ions/(cm2·s)的注入劑量為誘變的最適劑量，其存活率為22.87%。由圖8篩選結(jié)果可以看出，經(jīng)過7d搖瓶篩選后，獲得1株高產(chǎn)菌株N11，其產(chǎn)酸量為24.12g/L。與UV7菌株產(chǎn)酸量18.50g/L相比，提高30.38%，與NV3相比，產(chǎn)酸量提高2.29%，與原始菌株2336產(chǎn)酸量12g/L相比，更是提高101%。

2.3 菌種的生長曲線

圖 9 米曲霉2336生長曲線Fig.9 Time courses of cell growth and kojic acid production of the parent strain 2336

圖 10 米曲霉N11生長曲線Fig.10 Time courses of cell growth and kojic acid production of the mutant strain N11

由圖9可知，米曲霉2336發(fā)酵產(chǎn)曲酸量第7天達(dá)到最大值；生物量在第5天達(dá)到最大。所以，米曲霉2336的發(fā)酵周期為7d。圖10可以看出，誘變菌種N11發(fā)酵產(chǎn)酸量也是在第7天達(dá)到最大值；生物量在第6天達(dá)到最大。所以，米曲霉N11的發(fā)酵周期也為7d。

2.4 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

誘變菌種N11經(jīng)過6次傳代實驗，每次傳代1號瓶與2號瓶兩個平行瓶之間的曲酸產(chǎn)量相差不大，整體產(chǎn)酸量均保持在23.65g/L左右，菌株性能穩(wěn)定，結(jié)果見圖11。而誘變菌種NV3傳代到第2代時，產(chǎn)酸量就由原來的23.58g/L降到了17.45g/L(結(jié)果未顯示)，出現(xiàn)了明顯的下降。經(jīng)過紫外、N+注入復(fù)合誘變選育出1株高產(chǎn)菌株N11，該菌株的產(chǎn)酸量達(dá)到24.12g/L，比出發(fā)菌株提高101%。比以往的傳統(tǒng)單因素誘變提高顯著，雖然結(jié)果與采用紫外、亞硝酸鹽的復(fù)合誘變獲得的菌株NV3相比，產(chǎn)量只提高2.29%，但是經(jīng)過傳代實驗后，NV3在傳代到第2代就出現(xiàn)產(chǎn)量明顯下降的情況，而N11經(jīng)過傳代6次后，產(chǎn)量基本保持在23.65g/L左右，說明采用N+注入這種化學(xué)誘變、物理誘變?yōu)橐惑w的綜合誘變方法能夠得到遺傳穩(wěn)定性更好的高產(chǎn)菌株，再加上離子注入誘變除了引起微生物能量沉淀造成機(jī)體損傷外，還可以產(chǎn)生動量傳遞和遺傳物質(zhì)原子移位、重排，它本身就相當(dāng)于一種復(fù)合誘變，比單一誘變更有效。因此證明本復(fù)合誘變是一種更有效的誘變方法，對提高菌種產(chǎn)酸水平有非常好的效果。

圖 11 米曲霉N11傳代結(jié)果Fig.11 Genetic stability of the mutant strain N11 for kojic acid production

3 結(jié) 論

3.1 從5種可產(chǎn)曲酸的實驗菌株中篩選出1株出發(fā)菌株CICC-2336，并且測定出其原始產(chǎn)酸量為12g/L。

3.2 經(jīng)過N+注入誘變的菌種，發(fā)生了較理想的正突變，隨著氮離子注入劑量的增加，菌株存活率曲線呈現(xiàn)較明顯的先降后升的“馬鞍型”變化。理想的注入條件為：注入能量10keV，注入劑量10×1014ions/(cm2·s)。

3.3 比較CICC-2336進(jìn)行紫外、N+注入的復(fù)合誘變和紫外、亞硝酸鹽的復(fù)合誘變的實驗結(jié)果，最終確定紫外、N+注入的復(fù)合誘變?yōu)檩^有效的誘變方法；經(jīng)過該復(fù)合誘變，菌株的產(chǎn)酸水平提高到24.12g/L，比原始菌株提高101%。

3.4 經(jīng)紫外、N+注入的復(fù)合誘變獲得的曲酸高產(chǎn)菌株經(jīng)過6次傳代實驗，產(chǎn)酸量基本維持在23.65g/L左右的水平，菌株性狀穩(wěn)定。

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