中心組合設(shè)計優(yōu)化熱帶假絲酵母菌冷凍干燥保護劑

王 華，賀金梅,2

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

中心組合設(shè)計優(yōu)化熱帶假絲酵母菌冷凍干燥保護劑

王 華1，賀金梅1,2

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

采用單因素試驗和響應(yīng)面中心組合設(shè)計，對熱帶假絲酵母菌真空冷凍干燥保護劑配方進行篩選和優(yōu)化。通過Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到保護劑最佳配方為：蔗糖14.15g/100mL、L-谷氨酸鈉7.07g/100mL、聚乙二醇1.10g/100mL，菌體存活率預(yù)測值為81.46%，實際值為82.73%。

熱帶假絲酵母菌；保護劑；中心組合設(shè)計；響應(yīng)面法

與液態(tài)微生物菌劑相比，固態(tài)微生物活菌劑，具有保藏期長、不易污染，而且在運輸和貯藏、質(zhì)量控制等方面有著其獨特的優(yōu)勢[1-2]，還可直接作為發(fā)酵劑、添加劑研制開發(fā)其他雙歧保健食品和醫(yī)藥制劑等優(yōu)點，因而受到越來越多的矚目[3]。

目前，國內(nèi)主要利用真空冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)固態(tài)活菌劑，但真空冷凍干燥過程中，冷凍和干燥兩個過程會造成部分微生物細(xì)胞的死亡、損傷及某些酶蛋白分子的鈍化[4]，具體表現(xiàn)在以下幾個方面：冷凍過程中水結(jié)冰時體積增大以及冰晶的機械作用，易破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性部位一些較弱的化學(xué)鍵；水結(jié)冰后溶質(zhì)濃度增加、pH值變化、離子強度增加、相分離；干燥過程中除去了與蛋白質(zhì)、磷脂等生物大分子結(jié)合的大部分水分子，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子變性失活，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能改變。因此，為了減少冷凍和干燥過程中對細(xì)胞活性的影響，通常加入不同類型的保護劑。保護劑可以改變微生物干燥時的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止干燥或復(fù)水對細(xì)胞的損害，盡可能保持微生物原有的各種生理生化特性和生物活性[5-7]，進而達到保護的目的，表1列出了常用的保護劑類型以及保護機理[8-11]。本實驗以熱帶假絲酵母菌為發(fā)酵菌種，采用中心組合設(shè)計并結(jié)合響應(yīng)面法，對熱帶假絲酵母菌冷凍干燥保護劑進行優(yōu)化。

表 1 保護劑類型及其保護機理Table 1 Cryoprotectants and mechanisms of action

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

熱帶假絲酵母(Candida tropical)購自中國微生物菌種保藏中心。

菌種活化培養(yǎng)基：5e Bé麥芽汁液體培養(yǎng)基；菌液擴大培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基)：馬鈴薯300g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL；菌落計數(shù)培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯300g、葡萄糖20g、瓊脂20g、氯霉素0.1g、蒸餾水1000mL。

1.2 試劑與儀器

蔗糖(分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乳糖(分析純) 成都市科氏化工試劑廠；聚乙二醇(分析純)天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司；L-谷氨酸鈉(生化試劑)、甘油、β-環(huán)狀糊精、硫酸錳、甘氨酸(均為分析純) 成都市科氏化工試劑廠。

ZHWY-200B恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；H1850R高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；VFD-2000 冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 菌種培養(yǎng)和收集

菌種經(jīng)過活化，然后在30℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)30h至穩(wěn)定期前期，4℃、6000r/min離心20min，收集菌泥。

1.3.3 活菌計數(shù)

稀釋平板菌落計數(shù)法[12]，28～30℃培養(yǎng)48h。

1.3.4 凍干后樣品的處理及菌體存活率計算

向凍干后樣品中加入10mL無菌的生理鹽水，于37℃培養(yǎng)箱中放置15min[13-14]；然后采用稀釋平板菌落計數(shù)法測定樣品中的活菌數(shù)。

1.3.5 真空冷凍干燥工藝

在無菌條件下，用無菌水將離心收集到的菌泥稀釋成活菌數(shù)為1h109CFU/mL的菌懸液；于無菌的培養(yǎng)皿中加入2mL菌懸液，然后按保護劑與菌泥體積比2:1的比例加入保護劑，保護劑與菌懸液平衡時間30min[15-16]；冷凍干燥各參數(shù)為：預(yù)凍溫度—40℃、預(yù)凍時間2h、升華溫度—30℃、解析溫度25℃、干燥時間24h、真空度3～10Pa[17-18]。

1.3.6 保護劑篩選

采用蔗糖、乳糖、聚乙二醇、L-谷氨酸鈉、甘油、β-環(huán)狀糊精、硫酸錳、甘氨酸8種保護劑，將上述幾種保護劑用蒸餾水配成不同質(zhì)量濃度的溶液，121℃滅菌20min后于4℃冰箱中備用。以蒸餾水作對照，測定凍干前后活菌數(shù)，計算菌體存活率。

1.3.7 中心組合設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，用Design-Expert軟件中的中心組合設(shè)計，對熱帶假絲酵母冷凍干燥保護效果較好的3種保護劑蔗糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇進行優(yōu)化，以凍干存活率為響應(yīng)值，以確定熱帶假絲酵母冷凍干燥保護劑最佳組合。試驗因素水平編碼見表2。

表 2 保護劑優(yōu)化試驗中心組合設(shè)計因素水平編碼表Table 2 Factors and their coded levels for central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 各種保護劑對熱帶假絲酵母菌凍干存活率的影響

圖 1 各種保護劑對熱帶假絲酵母菌凍干存活率的影響Fig.1 Effect of cryoprotectant type and concentration on the survival rate of Candida tropical after freeze-drying

從圖1可以看出，沒有添加任何保護劑的菌體凍干存活率只有8.21%，菌體存活率隨著各種保護劑添加量的增加而增加；當(dāng)乳糖、蔗糖、β-環(huán)狀糊精、L-谷氨酸鈉、甘氨酸、聚乙二醇、甘油、硫酸錳的質(zhì)量濃度分別為10、15、15、7、7、1、4、0.5g/100mL時，菌體存活率最大，分別為29.19%、37.78%、19.89%、27.92%、18.96%、28.47%、13.7%、11.99%；由于高質(zhì)量濃度的保護劑會加速細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)聚合，形成較強玻璃化結(jié)構(gòu)，反而不利于細(xì)胞的保存，且復(fù)水效果不好[19]，所以，當(dāng)保護劑的質(zhì)量濃度超過它們的最佳質(zhì)量濃度后，菌體存活率隨著各種保護劑添加量的增加反而下降。

其中蔗糖、乳糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇對熱帶假絲酵母菌凍干保護的效果較好，蔗糖、乳糖、L-谷氨酸鈉屬于滲透型保護劑，聚乙二醇屬于非滲透型保護劑[20]。蔗糖、乳糖、L-谷氨酸鈉能透過細(xì)胞壁，進入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度升高，細(xì)胞內(nèi)壓力接近于細(xì)胞外壓力，降低細(xì)胞外干燥或凍結(jié)引起的細(xì)胞脫水皺縮的程度和速度，從而減少了對細(xì)胞的損傷。聚乙二醇主要是保護細(xì)胞的表面免受傷害，在凍干時使溶液呈過冷狀態(tài)，降低了溶液結(jié)冰的速度，避免細(xì)胞在冷凍或加熱時由于鹽類濃縮，使細(xì)胞脫水而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的塌陷、滲透壓性休克、蛋白質(zhì)變性等不良后果[21]。另外，乳糖、蔗糖、聚乙二醇又是親水性保護劑，它們的羥基基團可與蛋白質(zhì)形成氫鍵，從而代替蛋白質(zhì)極性基團周圍的水分子，使蛋白質(zhì)表面形成一層水化膜保護氫鍵，進而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)因干燥而變性[8]。

由單因素試驗研究表明，其他幾種保護劑對熱帶假絲酵母菌的保護效果都比較差，然而，即便是最佳質(zhì)量濃度的蔗糖，菌體最大凍干存活率也只有37.78%，因此，難以達到工業(yè)化生產(chǎn)凍干菌粉的目的。通常情況下，幾種保護劑復(fù)合使用，保護效果要比單一保護劑的效果好。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，雖然乳糖的保護效果達到29.19%，但它屬于還原糖，會與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，影響保護效果。因此，選用蔗糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇3種保護劑進行中心組合設(shè)計，以凍干存活率為響應(yīng)值，以確定熱帶假絲酵母冷凍干燥保護劑最佳組合。

2.2 中心組合設(shè)計試驗結(jié)果與分析

表 3 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 CCD arrangement and results

通過對蔗糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇3種保護劑進行中心組合設(shè)計(表2)，利用Design-Expert軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到二次回歸方程：

表 4 二次多項模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the fi tted regression quadratic model

二次多項式回歸分析結(jié)果顯示(表4)，回歸方程顯著性檢驗F= 14.86＞F0.01(9,10)=4.95，F(xiàn)失擬=3.06＜F0.05(5,5)= 5.05，說明所建立的回歸方程與實際情況擬合得好。通過Design-Expert軟件對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行方差分析表明，X1、X3、X12、X22、X32對凍干存活率影響顯著，其他各項影響不顯著。

圖2～4是根據(jù)多元回歸分析所作的響應(yīng)曲面圖，由此可以對任何兩因素交互影響熱帶假絲酵母菌菌體存活率進行分析，以確定最佳因素水平；隨著蔗糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇質(zhì)量濃度的增加，熱帶假絲酵母菌菌體存活率也隨之提高，但各保護劑質(zhì)量濃度增加到一定值后，菌體存活率反而開始下降。

圖 2 蔗糖和L-谷氨酸鈉對熱帶假絲酵母菌菌體存活率交互影響的三維曲面圖Fig.2 Response surface plot for the effect of sucrose and L-sodium glutamate on survival rate of cells

通過Design-Expert軟件的數(shù)據(jù)優(yōu)化程序求得當(dāng)蔗糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇的質(zhì)量濃度分別為14.15、7.07、1.10g/100mL時，熱帶假絲酵母菌菌體存活率能達到81.46%。按照保護劑的最佳配方，3次重復(fù)實驗，熱帶假絲酵母菌菌體存活率平均值為82.73%，與預(yù)測值接近，說明所建立回歸模型合理。

圖 3 蔗糖和聚乙二醇對熱帶假絲酵母菌菌體存活率交互影響的三維曲面圖Fig.3 Response surface plot for the effect of cross-interaction between sucrose and polyethylene glycol on the survival rate of Candida tropicalafter freeze-drying

圖 4L-谷氨酸鈉和聚乙二醇對熱帶假絲酵母菌菌體存活率交互影響的三維曲面圖Fig.4 Response surface plot for the effect of L-sodium glutamate and polyethylene glycol on the survival rate of Candida tropical after freeze-drying

3 結(jié) 論

研究采用單因素試驗和中心組合設(shè)計以及響應(yīng)面法，對熱帶假絲酵母菌真空冷凍干燥保護劑配方進行了篩選和優(yōu)化。單因素試驗結(jié)果表明，蔗糖、乳糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇的保護效果較好；通過響應(yīng)面優(yōu)化得到熱帶假絲酵母菌真空冷凍干燥保護劑的二次回歸方程：Y=—149.69640＋12.27837X1＋27.85516X2＋82.98039X3—0.013625X1X2—0.62050X1X3—1.04875X2X3—0.40639X12—1.87391X22—30.23713X32，保護劑最佳配方為蔗糖14.15g/100mL、L-谷氨酸鈉7.07g/100mL、聚乙二醇1.10g/100mL，驗證實驗熱帶假絲酵母菌菌體存活率平均值為82.73%。

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Optimization of Cryoprotectant Formulation for Candida tropical by Central Composite Design

WANG Hua1，HE Jin-mei1,2
(1. Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China；2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

A cryoprotectant formulation consisting of sucrose, L-sodium glutamate and polyethylene glycol for Candida tropical was optimized using a response surface central composite design. By regression analysis of the experimental data obtained, the optimum cryoprotectant formulation was found to consist of 14.15 g/100 mL sucrose, 7.07 g/100 mL L-sodium glutamate and 1.01 g/100 mL polyethylene glycol. The predicted survival rate of Candida tropical with the addition of the optimized cryoprotectant formulation after freeze-drying was 81.46%, which was close to the actual value of 82.73%.

Candida tropical；cryoprotectant；central composite design (CCD)；response surface methodology (RSM)

Q93.336

A

1002-6630(2013)01-0244-04

2012-09-06

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(柑橘)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-27-05B)

王華(1963ü)，男，研究員，學(xué)士，研究方向為柑橘深加工及貯藏。E-mail：wanghua40@126.com