冷卻豬肉優勢腐敗菌分離鑒定及致腐能力測定

黃 林，陳全勝，張燕華，畢夏坤，許 慧，趙杰文,*

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江西農業大學生物科學與工程學院，江西 南昌 330045)

冷卻豬肉優勢腐敗菌分離鑒定及致腐能力測定

黃 林1,2，陳全勝1，張燕華1，畢夏坤1，許 慧1，趙杰文1,*

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江西農業大學生物科學與工程學院，江西 南昌 330045)

分離鑒定冷卻豬肉中的優勢腐敗菌并測定其致腐能力，以研究冷卻肉腐敗機理。利用選擇性培養基和感官評定方法，從變質冷卻豬肉中分離篩選出優勢腐敗菌并鑒定到種。再將各優勢腐敗菌接種到滅菌肉塊上，4℃貯藏下定期測定各腐敗菌的菌落數和揮發性鹽基氮(TVB-N)，并以TVB-N產量因子(YTVB-N)衡量各腐敗菌的致腐能力。結果表明：經選擇性培養基分離和肉樣感官評定共篩選得到5株優勢腐敗菌即P3、PS1、J4、P5和S5，分別鑒定為Acinetobacter guillouiae、Pseudomonas koreensis、Bacillus fusiformis、Enterobacter cloacae和Brochothrix thermosphacta。進一步研究其腐敗特性發現，4℃貯藏時接種優勢腐敗菌的肉樣在第7天已明顯腐敗。PS1的TVB-N和YTVB-N明顯高于其他菌株。研究表明，從冷卻豬肉分離鑒定出的優勢腐敗菌中，PS1導致冷卻豬肉腐敗能力較強。

冷卻豬肉；優勢腐敗菌；分離；鑒定；致腐能力

冷卻豬肉能夠最大程度地保持肉品風味和營養價值，在我國大中城市已經逐步成為生鮮肉消費的主流。冷卻豬肉在冷藏過程中仍會腐敗變質，主要是由于微生物大量繁殖造成的，而且各種腐敗微生物競爭能力與代謝特征的差異會造成肉質腐敗的時間和特征不同，因此有必要開展冷卻豬肉中優勢腐敗菌腐敗特性的研究。大量研究表明，假單胞菌屬、腸桿菌科、不動桿菌屬、乳酸菌和熱殺索絲菌是引起冷卻豬肉腐敗變質的主要菌群[1-7]。在冷卻肉的初始菌相中假單胞菌占25%～26%，乳酸菌占20%～21%，微球菌和葡萄球菌屬占12%～15%，熱死環絲菌占12%～13%，腸桿菌科在19%～25%之間，但不同種類冷卻肉由于其屠宰工藝和理化特性不同，因而導致其腐敗的微生物種類和比例也會不同[8]。

目前研究主要集中在調查肉及肉制品中腐敗菌菌相的分布與變化方面，而在肉品具體致腐菌的鑒別及其腐敗能力方面相關研究較少，鑒于此，本研究著重以冷卻豬肉為研究對象，從中分離篩選出優勢腐敗菌并對其鑒別，再將它們回接至滅菌豬肉，4℃貯藏條件下定期檢測肉樣理化指標，并以產量因子(YTVB-N)定量描述冷卻豬肉優勢腐敗菌的腐敗能力，確定其中的主要腐敗菌，為開展冷卻豬肉主要腐敗菌腐敗機理及生長動力學研究打下基礎，以便有針對性地對冷卻豬肉中的優勢腐敗菌加以控制，為冷卻豬肉的保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用豬肉為當天屠宰的取自豬身上的冷卻里脊肉，購于江蘇鎮江歐尚超市肉制品專柜。

1.2 培養基與試劑

選擇培養基[5,9]：營養瓊脂培養基、PSA培養基、VRBGA培養基、STAA培養基。

用于PCR擴增的全套試劑和擴增引物 生工生物工程(上海)股份有限公司；氧化鎂、硼酸、鹽酸(均為分析純) 江蘇鎮江華東器化玻有限公司。

1.3 儀器與設備

YX400Z高壓滅菌鍋 上海安銳自動化儀表有限公司；VS-300型潔凈工作臺 蘇州鴻基潔凈科技有限公司；凝膠成像系統 Alpha Innotech公司；PTC-200 PCR擴增儀 美國MJ Research公司。

1.4 方法

1.4.1 冷卻豬肉腐敗菌的分離純化

無菌操作從變質冷卻豬肉表面取樣10g，無菌剪刀剪碎，放入90mL無菌生理鹽水中，封口后120r/min振搖30min，取上清液進行10倍稀釋，選擇3個合適稀釋度，每個稀釋度做3個重復，傾注含有不同選擇培養基的平板適溫培養。然后挑取各種典型生長的菌落，反復進行平板劃線分離，得到純化的單菌落，轉接于相應培養基斜面保存備用。

1.4.2 優勢腐敗菌的篩選

將分離純化的各菌株重新培養24h后，用無菌水分別制成菌懸液，搖勻，涂片染色顯微直接計數法測定菌液濃度[9]，調整菌體濃度為104～105CFU/mL。再在潔凈工作臺中將冷卻豬肉用酒精燈進行表面滅菌，并以壓片法鏡檢，確認該滅菌操作良好。然后分割成20g左右厚度均勻的小塊，浸泡于104～105CFU/mL菌液中，10s后取出放于無菌塑料袋中，每個菌株接種2個肉塊，以未接種腐敗菌的肉塊作對照，4℃冰箱保存。每天對肉塊進行感官評定比較[5,10]，以腐敗最快肉樣接種的菌株作為初篩腐敗菌，選取其中優勢腐敗菌進行菌種鑒定及致腐能力的測定，進一步研究其致腐特性。

1.4.3 優勢腐敗菌的鑒定

1.4.3.1 菌落特征和菌體形態特征觀察

觀察初篩所得優勢腐敗菌單菌落的形態。并挑取培養18～24h長勢好的單菌落，通過革蘭氏染色、鞭毛染色和芽孢染色觀察細胞個體形態。

1.4.3.2 生理生化實驗

根據Brown[11]推薦的肉品微生物鑒定圖譜，結合常見細菌系統鑒定手冊[12]進行氧化酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化發酵(O/F)和精氨酸雙水解酶實驗。

1.4.3.3 菌株的分子鑒定[13]

挑取培養18～24h單菌落用無菌ddH2O制成菌懸液，10000r/min離心10min，棄上清，加入100μL ddH2O，制得模板DNA，并采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)擴增菌株的16S rRNA基因[14]。以模板DNA 2μL、GoTaq Green Master Mix(2h)25μL、27F上游引物1μL、1541R下游引物1μL和ddH2O 21μL為PCR反應體系。95℃預變性5min，然后95℃變性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min 30s完成30個循環。再用1hTAE配制1%瓊脂糖凝膠，以DNA green為分子質量標準，取5μL PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統拍攝記錄電泳圖。最后將PCR擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。并登錄NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)，將所得序列與數據庫已知序列進行比對，獲得相似性99%以上的菌株序列，使用MEGA 5.04軟件構建Neighbor-Joining系統發育樹。

1.4.4 優勢腐敗菌致腐能力的測定[5,15]

將初篩菌株按方法1.4.2節制成菌液接種至滅菌肉塊放于無菌袋中，以未接腐敗菌肉塊作對照，4℃冰箱保存。于第1、2、4、6、8天各取2個肉樣進行菌落數[16]和揮發性鹽基氮(TVB-N)測定(半微量定氮法)[17]。并以TVB-N產量因子(YTVB-N)作為各種腐敗菌腐敗能力的定量指標。

YTVB-N/(mg TVB-N/CFU)=

2 結果與分析

2.1 優勢腐敗菌的分離篩選

將變質冷卻豬肉稀釋液涂布不同選擇性培養基培養，從中挑選具有典型特征的菌落28株，經純化后制成菌液，接種至滅菌冷卻豬肉進行致腐實驗，通過感官評定比較，發現接種菌株J4、PS1、S5、P3和P5的5個肉樣腐敗較快，前3d顏色略轉為紅色，失去光澤，略有異味；第5天開始聞到臭味，顏色變暗，表面變軟失去彈性并開始有黏液；第7天具有較強腐臭味，肉樣呈暗紅色，表面軟爛且黏液豐富，肉樣已明顯腐敗。不同微生物因其生物學特征及利用肉中營養物質的能力不同，造成肉質腐敗快慢的不同，表明其對豬肉的致腐能力也有所差異。由此，篩選得到引起肉樣腐敗較快的5個優勢腐敗菌株J4、PS1、S5、P3和P5，進一步研究其生物學特征和腐敗特性。

2.2 優勢腐敗菌的鑒定

2.2.1 形態特征和生理生化特征

通過選擇性培養基和感官評定篩選得到的5個優勢腐敗菌，觀察其菌落特征、形態特征和部分生理生化特征，結果見表1。

根據Brown推薦的肉品微生物鑒定圖譜，并結合常見細菌系統鑒定手冊中的鑒定分類系統，由表1結果可以初步判定，J4為芽孢桿菌屬，PS1為假單胞菌屬，S5為索絲菌屬，P3和P5為腸桿菌科。

2.2.2 優勢腐敗菌16S rRNA的PCR擴增與系統發育樹的構建

表 1 各種優勢腐敗菌的菌落特征、形態特征和部分生理生化特征Table 1 Colonial, morphological and physiological characteristics of dominant spoilage bacteria

圖 1 5個菌株的16S rRNA PCR擴增產物電泳圖譜Fig.1 Electropherogram of PCR amplif i cation products of 16S rRNA genes from fi ve strains

圖 2 基于16S rRNA序列同源性的5株細菌系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the fi ve strains based on 16S rRNA sequences

由圖1可知，將篩選得到的5個優勢腐敗菌以總DNA為模板PCR擴增后經電泳檢測，均得到了1.5kb左右的條帶。并將PCR擴增產物送至上海生工公司進行測序，測得它們的16S rRNA序列并與GenBank數據庫已有的序列比對，選取同源性在99%以上的菌株序列構建系統發育樹，結果見圖2。由系統發育樹結合菌落特征、形態特征和生理生化特征可以看出：P3與不動桿菌屬的Acinetobacter guillouiae親緣關系最近，P5與腸桿菌屬的Enterobacter cloacae親緣關系最近，PS1與假單胞菌屬的Pseudomonas koreensis親緣關系最近，J4與芽孢桿菌屬的Bacillus fusiformis親緣關系最近，S5與索絲菌屬的Brochothrix thermosphacta親緣關系最近。故該5株優勢腐敗菌分別鑒定為Acinetobacter guillouiae P3、Pseudomonas koreensis PS1、Bacillus fusiformis J4、Enterobacter cloacae P5和Brochothrix thermosphacta S5。

Acinetobacter guillouiae在有氧條件下感染到肉品中能引起肉質腐敗，主要利用氨基酸作為生長基質，不產生異味的代謝產物，其致腐能力較低。Enterobacter cloacae廣泛存在于自然界中，感染到肉樣表面后，在有氧條件下利用葡萄糖和6-磷酸葡萄糖生長，并分別以分解氨基酸產生異味的腐胺和尸胺等胺類物質。Pseudomonas koreensis存在于土壤中，在冷卻牛肉中也曾被分離到，能較強地利用肌氨酸和肌氨酸酐，是冷卻肉中的優勢腐敗菌[18]。Bacillus fusiformis屬于芽孢桿菌屬，是一種好氧性、可以形成芽孢的革蘭氏陽性桿菌，廣泛分布于土壤和污水中，能利用糖類、蛋白質等營養成分生長，是引起食品腐敗變質的常見污染菌。Brochothrix thermosphacta能利用葡萄糖作為生長底物，在有氧條件下生成乙酸及乙偶姻，產生甜的異味，并能分解亮氨酸和纈氨酸產生揮發性酸，在微氧條件下可能成為主要的腐敗菌[19]。這些腐敗菌可能是因為豬肉在屠宰、運輸和銷售過程中污染并在4℃低溫貯藏過程中繁殖逐漸成為優勢腐敗菌。

2.3 優勢腐敗菌接種滅菌冷卻豬肉后菌落總數和TVB-N的變化

將初篩得到的5個優勢腐敗菌回接至冷卻豬肉，4℃貯藏條件下定期取樣測定菌數繁殖和TVB-N變化，見圖3、4。

圖 3 各種優勢腐敗菌菌落數變化Fig.3 Growth curve of dominant spoilage bacteria inoculated to sterilized pork

圖 4 接種各種優勢腐敗菌對TVB-N值的影響Fig.4 Effect of dominant spoilage bacteria on TVB-N value in pork

微生物的生長繁殖是引起肉質腐敗的主要原因，因此微生物的數量是衡量肉質腐敗程度的一個重要指標。而TVB-N是由于肉類在微生物作用下，分泌一系列酶引起的脫氨、脫羧作用，導致蛋白質分解而形成的產物，是評價肉質新鮮度最重要的指標。由圖3可知，貯藏過程中各腐敗優勢菌和對照組菌落數均呈增加趨勢，且在第5天進入穩定期，各優勢腐敗菌菌落數均超過9.0(lg(CFU/g))，顯著大于對照組菌落數8.30(lg(CFU/g)) (P＜0.05)。說明接種至肉樣中的各優勢腐敗菌及肉樣自身所帶的細菌，在4℃低溫下仍能利用豬肉中糖類和蛋白質等營養物質迅速生長繁殖，菌數明顯增加，但隨著氧氣和營養物的消耗及生物胺、有機酸等代謝產物的累積，導致菌體增長減慢并進入穩定期。圖4表明，TVB-N值在第1天后才明顯增加，在第3天均達到15mg/100g以上，到第7天接近25mg/100g，肉質達到腐敗程度，且接種優勢腐敗菌各組肉樣的TVB-N值在第3天后均顯著高于對照組(P＜0.05)，說明腐敗菌的生長繁殖是導致TVB-N產生的主要原因。且各腐敗菌在利用肉質糖分后才進一步分解蛋白質而產生生物胺，并隨著菌數的增加，生成的生物胺也快速增加，但在第3天后因為生物胺及有機酸的累積反饋抑制了生物胺的形成，從而導致生物胺的增長速度有所減緩。這與Jiang Yun[7]、黎園園[10]等研究肉中腐敗微生物生長及TVB-N產生狀況基本一致。這些規律可為控制冷卻豬肉中的優勢腐敗菌，保障肉品質量提供理論依據。

2.4 優勢腐敗菌腐敗能力定量分析

不同腐敗菌利用肉中的營養物質產生代謝產物有所不同，本實驗以TVB-N產量因子(YTVB-N)作為各優勢腐敗菌腐敗能力的定量分析指標，結果見表2。

表 2 各種優勢腐敗菌的TVB-N產量因子Table 2 Yield factors of TVB-N of dominant spoilage bacteria

有研究表明，測定菌株的腐敗能力和產生異臭味的能力是可以確定肉類腐敗菌的一種方法。腐敗代謝產物的產量因子可作為評價肉類腐敗菌腐敗能力的定量指標，可選擇三甲胺(TMA)、TVB-N、組胺或其他可能與腐敗有關的代謝產物的產量因子作為評價指標[15,20-21]。由表2可知，接種菌株PS1(Pseudomonas koreensis)肉樣的YTVB-N明顯高于其他菌株，而菌株P5(Enterobacter cloacae)的YTVB-N相對較低。由于不同腐敗菌利用分解肉品中蛋白質產生的代謝物不同，引起肉品腐敗的程度和特性的不同。TVB-N含量是目前評價肉品新鮮度的國家標準[17]，而YTVB-N可定量地表示每種優勢腐敗菌在相同時間內產生TVB-N的量，由此可反映不同優勢腐敗菌導致豬肉腐敗能力的差異。研究表明P. koreensis PS1導致冷卻豬肉腐敗能力較強，B. fusiformis J4和B. thermosphacta S5導致腐敗也比較快，而A. guillouiae P3和E. cloacae P5腐敗能力較弱。

3 結 論

本研究從冷卻變質豬肉中分離并通過感官評定比較篩選得到5株優勢腐敗菌，結合形態、生理生化特征及16S rRNA分子鑒定方法，分別鑒定為Acinetobacter guillouiae P3、Pseudomonas koreensis PS1、Bacillus fusiformis J4、Enterobacter cloacae P5和Brochothrix thermosphacta S5。

將篩選得到的5個優勢腐敗菌接種到滅菌肉塊中，4℃貯藏條件下比較各腐敗菌菌落數和TVB-N的增長情況及TVB-N產量因子(YTVB-N)，研究表明P. koreensis PS1導致冷卻豬肉腐敗能力較強，B. fusiformis J4和B. thermosphacta S5導致腐敗也較快，而A. guillouiae P3和E. cloacae P5腐敗能力較弱。

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Isolation, Identif i cation and Spoilage Capability of Dominant Spoilage Bacteria in Chilled Pork

HUANG Lin1,2，CHEN Quan-sheng1，ZHANG Yan-hua1，BI Xia-kun1，XU Hui1，ZHAO Jie-wen1,*
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. College of Biological Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In order to study the spoilage mechanism of chilled meat, dominant spoilage bacteria in chilled pork were isolated using selective medium and sensory evaluation and identified and their spoilage capability was measured by inoculating each identif i ed strain to sterilized pork, determining total volatile basic nitrogen (TVB-N) value and bacterial population during storage at 4 ℃ and calculating TVB-N production factor (YTVB-N). Five strains of dominant spoilage bacteria, designated as P3, PS1, J4, P5 and S5, were obtained and identified as Acinetobacter guillouiae, Pseudomonas koreensis, Bacillus fusiformis, Enterobacter cloacae and Brochothrix thermosphacta, respectively. After 7 days of storage at 4 ℃, pork inoculated with each of them spoiled visibly. Strain PS1 provided signif i cantly higher levels of TVB-N and YTVB-Nthan other spoilage bacteria. This indicates that Pseudomonas koreensis has potent spoilage capability in chilled pork.

chilled pork；dominant spoilage bacteria；isolation；identif i cation；spoilage capability

TS201.3

A

1002-6630(2013)01-0205-05

2011-10-19

江蘇省自然科學基金項目(BK2009216)；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目 (CXLX11_0603)

黃林(1977ü)，男，講師，博士研究生，研究方向為農產品特性及其品質無損檢測。E-mail：huanglin213@126.com

*通信作者：趙杰文(1945ü)，男，教授，博士，研究方向為農產品、 食品無損檢測及其融合技術。E-mail：zhao_jiewen@ujs.edu.cn