傳統(tǒng)毛霉型豆豉中苯甲酸形成機理的研究

沈祥森，闞建全,*，馮鑠涵，李 帥，謝德芳，曾凡玉

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715；3.永川豆豉食品有限公司，重慶 402160)

傳統(tǒng)毛霉型豆豉中苯甲酸形成機理的研究

沈祥森1,2，闞建全1,2,*，馮鑠涵1,2，李 帥1,2，謝德芳3，曾凡玉3

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715；3.永川豆豉食品有限公司，重慶 402160)

通過高效液相色譜(HPLC)方法分析測定傳統(tǒng)毛霉型豆豉在不同發(fā)酵時期的苯甲酸、苯丙氨酸和β-苯丙烯酸(肉桂酸)的含量以及苯丙氨酸解氨酶酶活性的變化趨勢，以研究苯甲酸在傳統(tǒng)毛霉型豆豉的發(fā)酵生產(chǎn)中的形成機理，揭示傳統(tǒng)毛霉型豆豉中苯甲酸在非人為添加情況下自然存在的原因。結(jié)果表明：在制曲2d(S3)時，苯甲酸含量為2.43mg/kg，隨后其含量不斷增加，到后發(fā)酵215d(S14)時，達到37.23mg/kg；而苯丙氨酸含量也由原料大豆的4.89mg/100g增加到了S14(后發(fā)酵第215天)中的272.23mg/100g；中間產(chǎn)物β-苯丙烯酸在制曲階段含量較高，在后發(fā)酵階段逐漸減少，并且其在制曲階段含量較大時苯甲酸增加趨勢明顯，在后發(fā)酵階段含量較小時苯甲酸含量增加趨勢不明顯；同時催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為β-苯丙烯酸(肉桂酸)這一反應(yīng)的苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性在制曲階段較強，在后發(fā)酵階段逐漸減弱。在后發(fā)酵階段人為添加β-苯丙烯酸后通過動態(tài)檢測得出苯甲酸、β-苯丙烯酸含量呈現(xiàn)一升一降的結(jié)果。因此可以得出，傳統(tǒng)毛霉型豆豉中苯甲酸形成的機理可能為：大豆中的蛋白質(zhì)首先部分水解為氨基酸，其中的苯丙氨酸在PAL的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)棣?苯丙烯酸，β-苯丙烯酸在一定條件下最終氧化形成苯甲酸。

傳統(tǒng)毛霉型豆豉；苯甲酸；苯丙氨酸；β-苯丙烯酸；苯丙氨酸解氨酶；形成機理

豆豉(douchi)，古名 幽菽，是一種以黑豆、黃豆為主要原料，利用微生物發(fā)酵制成的一種調(diào)味食品。豆豉在加工過程中破壞了胰蛋白酶抑制劑，產(chǎn)生的纖維素酶使纖維素水解生成單糖，蛋白酶使蛋白質(zhì)水解生成多肽、氨基酸等，這些多肽具有促進能量代謝及減肥效果、提高免疫力、調(diào)節(jié)胰島素、降低血壓、血脂和膽固醇、抑制腫瘤及抗氧化等多種生物活性[1]。同時豆豉中，不僅含有大豆中原有的營養(yǎng)素，而且通過微生物的發(fā)酵作用又產(chǎn)生了很多對人體有保健作用的活性物質(zhì)，如含有人體所需的多種氨基酸和維生素等。豆豉以其獨特的滋味使人增加食欲，不僅是佐餐佳品，并且可以入藥。豆豉中含有很高的尿激酶，尿激酶具有溶解血栓的功能。豆豉中含有的營養(yǎng)素可以改善胃腸道菌群，因此常吃豆豉可起到幫助消化、預(yù)防疾病、延緩衰老、增強腦力、降低血壓、消除疲勞、減輕病痛、預(yù)防癌癥和提高肝臟解毒(包括酒精毒)的作用[2]。因此，豆豉深受廣大群眾所喜愛，是純天然的黑色食品。

按制曲微生物不同，豆豉可分為細菌性豆豉(如四川水豆豉、日本納豆)、毛霉型豆豉(如永川豆豉、潼川豆豉)、根霉型豆豉(如印尼丹貝)和曲霉型豆豉(如廣東陽江豆豉、湖南瀏陽豆豉)；按發(fā)酵時間是否加食鹽，分為咸豉、淡豉；按成品含水量多少，分為干豉、濕豉和水豉。我國主要生產(chǎn)毛霉、曲霉型豆豉及少量細菌性豆豉(俗稱水豆豉)，國外以丹貝Tempeh(印度尼西亞根霉型豆豉)和納豆Natto(日本細菌型豆豉)最為著名[3]。我國的毛霉型豆豉在實際生產(chǎn)中遇到這樣一個問題：產(chǎn)品中檢出了不應(yīng)檢出的苯甲酸[4]，生產(chǎn)企業(yè)很困惑。對于此，國內(nèi)外沒有相關(guān)文獻的直接報道，但有一些間接報道，例如，1966年，Ogata等[5]在研究芳香族氨基酸的微生物代謝時發(fā)現(xiàn)，紅酵母屬中的某些種能以L-苯丙氨酸為唯一碳、氮源生長，并在培養(yǎng)基中積累肉桂酸。有研究[6]報道在研究生物體苯丙氨酸代謝時發(fā)現(xiàn)短桿菌(Brevibacterium flavum)、諾卡菌(Nocardia farcinica)、中高溫放線菌(Actinomycete)、微桿菌屬(Microbacterium Orla-Jensen)菌株及一些霉菌菌株細胞破碎后的粗提液中可測到一種能作用于芳香族氨基酸的脫氫酶即苯丙氨酸脫氫酶(PAL)。這種酶是苯丙氨酸代謝的關(guān)鍵酶，它能夠催化L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸。Nakushima等[7]通過電鏡技術(shù)對細胞亞顯微結(jié)構(gòu)進行研究顯示，PAL分散在細胞的基質(zhì)，存在于高爾基體囊泡和次生壁加厚層中。隨后，該酶相繼在其他微生物中被發(fā)現(xiàn)，主要屬于霉菌與酵母菌。如鏈霉菌屬(Streptomyces)、枝孢霉屬(Cladosporium)、共頭霉(Symcephalasilrum)、內(nèi)孢霉屬(Endomuces)、曲霉屬(Asperhillus)、地霉屬(Geotrlcum)、從梗孢屬(Monilella)、小叢殼屬(Glomerella)、卵孢酵母屬(Oosporidium)、類酵母屬(Saccharomycodes)、擲酵母屬(Sporidlobolus)。肉桂酸通過自然氧化后，其氧化終產(chǎn)物即是苯甲酸。本實驗通過對苯甲酸化學(xué)結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)的分析，發(fā)現(xiàn)從苯丙氨酸形成苯甲酸的可能途徑為：苯丙氨酸在微生物苯丙氨酸解氨酶的催化下首先轉(zhuǎn)變?yōu)槿夤鹚岷桶保夤鹚嵩谝欢l件下最終形成苯甲酸[8-9]。本實驗通過HPLC方法檢測傳統(tǒng)毛霉型豆豉在不同發(fā)酵時期的苯甲酸、苯丙氨酸和β-苯丙烯酸(肉桂酸)的含量以及苯丙氨酸解氨酶酶活性的變化趨勢，以研究并驗證苯甲酸在傳統(tǒng)毛霉型豆豉發(fā)酵生產(chǎn)中的形成機理是否是該條途徑，從而揭示傳統(tǒng)毛霉型豆豉中苯甲酸在非人為添加情況下自然存在的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

所用的材料均為2010年12月10日于重慶市永川豆豉食品有限公司按隨機方法抽取所得，屬于不同加工階段的毛霉型豆豉，原料大豆產(chǎn)地為吉林省。所有豆豉樣品取回后，部分樣品立即進行苯丙氨酸解氨酶酶活性的測定，其余樣品放入密閉的壇子中在自然環(huán)境下進行后發(fā)酵到規(guī)定的時間取出進行測定。

永川傳統(tǒng)毛霉型豆豉生產(chǎn)工藝流程如下：大豆篩選→浸泡→瀝干→常壓蒸料→冷卻→自然發(fā)酵制曲→翻曲→拌料(15%食鹽、醪糟、白酒等)→入罐發(fā)酵后熟→成品

表1中S1～S14分別代表了在不同生產(chǎn)時期按隨機方法抽取所得的豆豉樣品。

表 1 不同加工時期按隨機方法抽取所得的豆豉樣品的狀態(tài)及其編號Table 1 Sampling and sample designation

1.2 試劑與儀器

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品、β-苯丙烯酸標(biāo)準(zhǔn)品、苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、甲醇、乙腈均為色譜純；磷酸二氫鉀、硼酸、碳酸氫鈉、碳酸鈣、乙二胺四乙酸、鹽酸、乙醚、石油醚均為分析純。

UV-2450紫外分光光度計、LC-20A高效液相色譜儀日本島津公司；5810臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；ALPAAI-4LSC冷凍干燥機 美國Christ公司；SIMF140AY65制冰機 日本三洋公司；微孔過濾器(濾膜0.45μm)。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將取自不同發(fā)酵時期的豆豉樣品在—15℃冷凍干燥3d以去除水分，再用研磨機粉碎成粉，過80目，置于低溫冰箱(—18℃)中冷凍保藏(酶活力實驗的樣品除外)。

1.3.2 苯丙氨酸含量的HPLC法測定[10-12]

1.3.2.1 溶液的配制

DNFB溶液的配制：精密量取0.25mL DNFB，置于25mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，用塞子塞好，并用封口膜密封，即得0.1g/L的DNFB溶液，置于4℃冰箱保存。

苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品1.0000g，用超純水溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度60、120、150、240、300μg/mL的苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2.2 樣品制備及測定

稱取2.50g豆豉樣品，用去離子水充分溶解并稀釋至25mL，搖勻，放入超聲波儀器中30℃超聲1h，使樣品充分溶解。再轉(zhuǎn)入50mL離心管中，11000r/min離心10min。精密吸取上清液1.0mL置于10mL棕色容量瓶中，加入0.5mol/L pH值為9.0的碳酸氫鈉溶液1.0mL，再加入DNFB溶液1.0mL，混勻，用塞子塞好，放入恒溫水浴鍋中，暗處避光于60℃反應(yīng)60min后取出，水浴避光冷至室溫。用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)定容，放置15min，0.45μm極性濾膜過濾后供液相色譜分析。

1.3.2.3 HPLC色譜分析條件

色譜柱為Inertsil ODS-SP(250mmh4.6mm，5μm)；流動相：A相為0.05mol/L醋酸鈉緩沖溶液，pH6.50；B相為乙腈-水溶液(1:1，V/V)；流速1.0mL/min；柱溫23℃；檢測波長360nm；進樣量10μL。

1.3.2.4 苯丙氨酸含量的計算

分別準(zhǔn)確吸取樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)液10μL，注入高效液相色譜儀進行分析，以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時間定性，以其峰面積計算出樣液中被測物質(zhì)的含量。

式中：X為樣品中苯丙氨酸含量/(mg/100g)；S1為樣品峰面積；ρ為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度/(mg/mL)；S2為標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積；V為樣品定容體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g。

1.3.3 β-苯丙烯酸含量的測定[13]

1.3.3.1 樣品制備

稱取2.00g豆豉待測樣品，加5%鹽酸溶液1mL酸化，置于具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷-甲醇(2:1，V/V)溶液20mL，室溫下浸泡30min，過濾，精密吸取濾液10mL，室溫下?lián)]干，殘渣用甲醇溶解并定容至5mL，即得供試品溶液，經(jīng)0.45μm極性濾膜過濾后供液相色譜分析。

1.3.3.2 HPLC色譜分析條件

色譜柱為Agilent HC-C18(250mmh4.6mm，5μm)；流動相：甲醇(A相):0.1%磷酸(B相)=49:51；流速1.0mL/min；檢測波長280nm；進樣量10μL；柱溫25℃。

1.3.3.3 β-苯丙烯酸含量的計算

準(zhǔn)確吸取樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)液10μL，注入高效液相色譜儀進行分析，以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時間定性，以其峰面積計算出樣液中被測物質(zhì)的含量。

式中：X為樣品中β-苯丙烯酸含量/(mg/kg)；S1為樣品峰面積；ρ為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度/(mg/mL)；S2標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積；V為樣品定容體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g。

1.3.4 苯甲酸含量的測定[14-16]

1.3.4.1 溶液的配制

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取苯甲酸0.500g置于25mL容量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，混勻，即得混合標(biāo)準(zhǔn)液，質(zhì)量濃度為20mg/mL。

乙酸銨溶液(0.02mol/L)：稱取1.54g乙酸銨，加超純水溶解并定容至1000mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾即得。

1.3.4.2 樣品的制備及處理

稱取2.50g均勻粉碎冷凍干燥后的豆豉，置于25mL離心管中。加入1.0mol/L鹽酸0.5mL，用10mL乙醚提取2次，每次振搖2min，將上層乙醚提取液移入另一個25mL離心管中，合并乙醚提取液。用3mL氯化鈉酸性溶液(4.0g/L)洗滌2次，靜置15min，用滴管將乙醚層通過無水硫酸鈉濾入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混勻。準(zhǔn)確吸取5mL乙醚提取液于10mL離心管中，置40℃水浴上氮吹至干，加入1.00mL流動相(甲醇、0.02mo1/L乙酸銨體積比5:95)，經(jīng)0.45μm極性濾膜過濾后供液相色譜分析。

1.3.4.3 色譜分離條件

色譜柱為Agilent HC-C18(250mmh4.6mm，5μm)；流動相：乙酸銨(A相):甲醇(B相)=10:90；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL；檢測波長：230nm；柱溫：35℃。

1.3.4.4 苯甲酸含量的計算

準(zhǔn)確吸取樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)液10μL，注入高效液相色譜儀進行分析，以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時間定性，以其峰面積計算出樣液中被測物質(zhì)的含量。

式中：X為樣品中苯甲酸含量/(mg/kg)；S1為樣品峰面積；ρ為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度/(mg/mL)；S2標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積；V為樣品定容體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g。

1.3.5 苯丙氨酸解氨酶酶活力的測定[17]

1.3.5.1 樣品制備及測定

準(zhǔn)確稱取不同時期豆豉5.00g，加0.50g乙二胺四乙酸(EDTA)、少許石英砂、適量冰塊，研磨成勻漿。加入pH 8.8硼酸緩沖液15mL，4℃、6000r/min離心10min，上清液為酶粗提取液。取1mL酶粗提取液，加0.02mol/L苯丙氨酸溶液4mL，加入pH 8.8硼酸緩沖液5mL，40℃水浴30min后，加入6mol/L鹽酸1.0mL終止反應(yīng)。測定1min內(nèi)290nm波長處吸光度變化，以吸光度變化0.001為1個酶活力單位(U)，酶活力表示為U/(mingg)。

1.3.5.2 PAL活力計算

式中：X為PAL活力/(U/(mingg))；ΔA為吸光度變化；t為反應(yīng)時間/min；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.6 后發(fā)酵階段添加β-苯丙烯酸后苯甲酸、β-苯丙烯酸含量動態(tài)變化研究

于后發(fā)酵階段豆豉(S14，約10kg)中人為定量添加50mL配制成5.0g/L的β-苯丙烯酸，于0、2、4、6、8、10d連續(xù)動態(tài)檢測豆豉中β-苯丙烯酸、苯甲酸含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

以上實驗數(shù)據(jù)均是3次平行實驗得到的數(shù)據(jù)，并利用SPSS 11.0、Excel 2007對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)毛霉型豆豉中苯丙氨酸含量的變化

經(jīng)HPLC法測定經(jīng)衍生后的苯丙氨酸含量靈敏準(zhǔn)確，測得不同質(zhì)量濃度的樣品峰面積(Y)與苯丙氨酸質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程Y = 377.96X—5909.1(R2= 0.9994)。結(jié)果表明：苯丙氨酸衍生物質(zhì)量濃度在60～300μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖 1 豆豉在發(fā)酵過程中苯丙氨酸含量的變化Fig.1 Change in phenylalanine content in douchi during fermentation

由圖1可知，豆豉在制曲過程中，由于微生物生長繁殖而分泌出蛋白酶、肽酶等，大豆蛋白質(zhì)在這些酶的作用下將水解生成氨基酸和肽類，所以其中苯丙氨酸的含量越來越多，尤其在制曲階段增長較快。總的含量由原料大豆(S1)的4.89mg/100g增加到后發(fā)酵第215天(S14)的272.23mg/100g。

2.2 傳統(tǒng)毛霉型豆豉中β-苯丙烯酸含量的變化

以β-苯丙烯酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，mg/L)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=278.67X—88.958(R2= 0.9997)。結(jié)果表明：β-苯丙烯酸質(zhì)量濃度在1～40mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

由圖2可知，在制曲的第2天(S3)，即有β-苯丙烯酸的出現(xiàn)。隨著制曲時間的延長，β-苯丙烯酸含量逐漸增加，在制曲第5天附近(S5)即達到最大值，之后含量基本保持穩(wěn)定，并維持到制曲第10天(S8)。進入后發(fā)酵階段后，β-苯丙烯酸含量呈下降趨勢。由此可以推測，β-苯丙烯酸是某個代謝途徑的中間產(chǎn)物，它在不斷生成也在不斷消耗。

β-苯丙烯酸含量的變化Fig.2 Change in β-cinnamic acid content in douchi during fermentation圖 2 豆豉加工過程中

2.3 傳統(tǒng)毛霉型豆豉中苯甲酸含量的變化

HPLC法測定苯甲酸含量簡單并且靈敏，測得不同質(zhì)量濃度苯甲酸對照品的峰面積。以峰面積(Y)與苯甲酸質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程：Y = 364.57X—1052.6(R2=0.9995)。結(jié)果表明：苯甲酸質(zhì)量濃度在10～200mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖 3 豆豉加工過程中苯甲酸含量的變化Fig.3 Change in benzoic acid content in douchi during fermentation

由圖3可知，在制曲2d(S3)時，苯甲酸含量為2.43mg/kg，隨后其含量不斷增加，到S14(后發(fā)酵215d)時，達到37.23mg/kg，以后就增加很緩慢了。

2.4 傳統(tǒng)毛霉型豆豉中苯丙氨酸解氨酶活力的變化

圖 4 豆豉加工過程中PAL酶活力Fig.4 Change in PAL activity in douchi during fermentation

由圖4可知，原料大豆PAL酶活力較低，經(jīng)過蒸煮后PAL失活。隨著大豆制曲階段時間的延長，在微生物作用下產(chǎn)生的微生物PAL酶活力增強，在制曲第10天(S8)附近達到最大值，這是制曲的最后階段。而在豆豉后發(fā)酵階段，由于加鹽和厭氧等的環(huán)境，微生物受到抑制，PAL酶活力也減弱。

2.5 后發(fā)酵階段(S14)豆豉中人為添加β-苯丙烯酸后苯甲酸、β-苯丙烯酸動態(tài)含量變化

圖 5 后發(fā)酵階段添加β-苯丙烯酸后苯甲酸、β-苯丙烯酸動態(tài)含量的變化Fig.5 Change in benzoic acid and β-cinnamic acid contents in douchi during post-fermentation with the addition of β-cinnamic acid

由圖5可知，在后發(fā)酵階段豆豉中(S14)人為添加β-苯丙烯酸后，苯甲酸的含量呈現(xiàn)增長趨勢，從37.23mg/kg增加到了10d后的44.01mg/kg，β-苯丙烯酸則從剛添加時的21.32mg/kg下降到了10d后的10.46mg/kg。兩種物質(zhì)的含量一升一降，但該比例并不是1:1的對應(yīng)關(guān)系，這是因為β-苯丙烯酸的氧化產(chǎn)物不僅有苯甲酸還有苯乙酮，所以兩者數(shù)量并不是一一對應(yīng)的，但是可以得出β-苯丙烯酸和苯甲酸二者是存在相應(yīng)的相關(guān)關(guān)系的。

3 討論與結(jié)論

在制曲前的原料大豆中，苯甲酸并未檢出。在制曲的第4天(S4)，開始檢出苯甲酸。隨著制曲時間的延長，苯甲酸含量呈上升趨勢。說明豆豉在整個發(fā)酵生產(chǎn)過程中，是有物質(zhì)轉(zhuǎn)化生成苯甲酸。

在制曲階段，苯丙氨酸含量增加明顯，在制曲的第2天(S3)也檢出了中間產(chǎn)物β-苯丙烯酸，且在這一階段苯甲酸含量增加明顯，苯丙氨酸解氨酶酶活性也強，隨著制曲時間的結(jié)束，豆豉生產(chǎn)進入后發(fā)酵階段，β-苯丙烯酸含量降低，苯甲酸的增加趨勢趨緩。當(dāng)β-苯丙烯酸含量在幾乎低于檢測值時，苯甲酸含量維持在37mg/kg左右不再增加。在后發(fā)酵階段人為添加β-苯丙烯酸后通過動態(tài)檢測得出苯甲酸、β-苯丙烯酸含量一升一降的結(jié)果，由于β-苯丙烯酸的氧化產(chǎn)物不僅有苯甲酸還有苯乙酮，所以兩者的數(shù)量關(guān)系并不是1:1的對應(yīng)關(guān)系，但可以說明β-苯丙烯酸與苯甲酸是存在著對應(yīng)的相關(guān)關(guān)系。由于苯甲酸是β-苯丙烯酸的氧化物，所以可能性結(jié)論為：豆豉在加工過程中由于微生物發(fā)酵所產(chǎn)生的蛋白酶使蛋白質(zhì)水解生成多肽、氨基酸等，其中就包括苯丙氨酸；苯丙氨酸在微生物(主要為霉菌)所產(chǎn)的苯丙氨酸解氨酶催化下脫掉氨基生成了β-苯丙烯酸，β-苯丙烯酸經(jīng)過代謝，最終氧化生成苯甲酸。

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Benzoic Acid Formation Mechanism in Traditional Fermented Douchi

SHEN Xiang-sen1,2，KAN Jian-quan1,2,*，F(xiàn)ENG Shuo-han1,2，LI Shuai1,2，XIE De-fang3，ZENG Fan-yu3
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage, Chongqing 400715, China；3. Yongchuan Douchi Food Co. Ltd., Chongqing 402160, China)

To explore the mechanism of benzoic acid formation during production of traditional fermented douchi and discover the reason for natural existence of benzoic acid without adding it, changes in the contents of benzoic acid, phenylalanine and β-cinnamic acid and phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity were determined by HPLC at different stages of fermentation. After 2 days of incubation, the benzoic acid content of the koji was 2.43 mg/kg and then gradually increased with increasing incubation time, reaching 37.23 mg/kg after 215 days of post-fermentation. Similarly, the phenylalanine content of the starting raw material (soybean) was 4.89 mg/100 g and increased to 272.23 mg/100 g after 215 days of post-fermentation. β-cinnamic acid showed a high level during the koji making stage, resulting in an obvious increase in benzoic acid level, but gradually declined during the post-fermentation stage, without considerably increasing benzoic acid level. Moreover, the PAL activity, which catalyzes the transformation of phenylalanine into β-cinnamic acid, was stronger during the koji making stage, but gradually became weaker during the post-fermentation stage. The contents of benzoic acid and β-cinnamic acid increased and decreased, respectively, due to addition of β-cinnamic acid during the post-fermentation stage. Hence, we conclude that the mechanism of benzoic acid formation during production of traditional fermented douchi may partial hydrolysis of proteins into peptides in the staring raw material, subsequent PAL-catalyzed transformation of phenylalanine into β-cinnamic acid and fi nal oxidization of β-cinnamic acid into benzoic acid under required conditions.

traditional fermented douchi；benzoic acid；phenylalanine；β-cinnamic acid；phenylalanine ammonia lyase；formation mechanism

TS201.3

A

1002-6630(2013)01-0150-05

2011-09-26

沈祥森(1986ü)，男，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：122171120@qq.com

*通信作者：闞建全(1965ü)，男，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)，食品生物技術(shù)。E-mail：ganjq1965@163.com