SRAP和ITS分子標記在大興安嶺地區野生黑木耳遺傳多樣性上的應用

張 旭，李 倩，劉華晶，劉科然，張鈺雪，劉騰飛，楊永迪

(東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030)

黑木耳學名Auricularia auricula(L.ex Hook)Underw，亦稱木耳、光木耳、云耳等，隸屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)，異擔子菌綱(Heterobasidiomycetes)，木耳目(Auriculariales)，木耳科 (Auriculariaceae)，木耳屬 (Auricularia)［1］。黑木耳經長期的人工馴化和自然選擇，其遺傳背景非常復雜，因此掌握其遺傳關系是黑木耳育種工作的關鍵。

隨著分子生物學研究的發展，基于PCR的標記體系類型多樣，應用廣泛，但各自的復雜性、可靠性與遺傳信息不同［2］，分子標記技術已經成為分析黑木耳遺傳多樣性的主要手段之一［3］。目前分子標記技術主要有RFLP、RAPD、ISSR、AFLP、SRAP等。在眾多的分子標記中，相關序列擴增多態性(Sequence－Related Amplified Polymorphism，SRAP)是一種新型的基于PCR的標記系統，由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros博士于2001年在蕓苔屬植物上開發出的新型分子標記技術［4］。SRAP利用特定引物對ORFs區域(Open Reading Frames)進行擴增，具有簡單、高效、高共顯性、重復性、易測序等優點，目前該技術已被用于馬鈴薯、甜瓜、油菜、大棗等作物［5］中，實現擴增。ITS(Internal transcribed spacer)是核糖體rDNA中介于18s與5.8s之間的ITS1、及5.8S與28S之間的ITS2的非編碼轉錄間隔區，進化速率較快且片段長度適中(高等真菌一般小于1 000bp)，加上協調進化，使得該片段在基因組不同重復單元間十分一致，成為高等真菌屬內種間及種群系統學研究的核基因標記［6］。真菌的rDNA的ITS區段的保守性基本上表現為種內相對一致、種間差異比較明顯，這一特點使得ITS區段不僅適合于屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統發育關系分析，而且非常適合于真菌物種的分子鑒定［7］。

目前對黑木耳野生菌株的種質資源研究尚處于空白階段，野生資源多樣性是否豐富決定能否選育出優質黑木耳菌株。開展黑木耳野生種質遺傳多樣性研究，對于黑木耳有益種質資源的收集、保存、評價和利用具有重要意義。本研究對黑龍江省境內大興安嶺地區采集的14株野生黑木耳菌株和該地區6個栽培面積較大的黑木耳菌株進行初步鑒定的基礎上，對黑木耳的rDNA ITS區段進行序列測定和序列特征比較分析，并進一步對ITS序列進行核酸序列數據庫GenBank同源性檢索比對，構建起系統發育樹，以期為基于傳統形態特征對20個黑木耳菌株的分類鑒定提供分子依據，為黑木耳優良菌種選育及建立種質資源信息庫提供依據。對野生黑木耳進行種質資源的分析與鑒定在國內外尚屬首次。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共20株，其中14個野生黑木耳樣品于2009—2010年采自大興安嶺地區(7～20號)，采樣后帶回實驗室進行菌株分離工作，6株栽培菌株選自大興安嶺地區栽培品種(1～6號)，具體情況見表1。

表1 供試材料及來源Tab.1 The tested strains and their locations

1.2 供試菌株的分離純化及培養

采用組織分離法對菌株進行組織分離培養，將活化后的菌種接入250mL三角瓶液體PDA培養基中培養，120rpm于搖床上培養7d得到菌絲備用。

1.3 菌株總DNA的提取

對菌絲體基因組總DNA采用改進的CTAB法提取。在含有0.5μg/mL溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠上檢測DNA樣品的質量和濃度，凝膠成像系統拍照記錄。

1.4 反應體系及程序

1.4.1 SRAP 反應體系及程序

根據Li和Quiros(2001)設計SRAP引物序列，設計6個上游引物和8個下游引物，由上海生物工程技術公司合成。從6個上游引物和8個下游引物組合的48對引物中挑選擴增效果較好、多態性高、穩定性較強的引物對樣品進行擴增。

PCR擴增體系為 25μL，含 1×PCR buffer，2 mmol/L MgC12，dNTPs 0.2mmol/L(TaKaRa)，Tag 酶 0.75U(TaKa-Ra)，模板DNA30 ng，正向和反向引物各30 ng，不足部分ddH2O補足。PCR擴增重復3次。

擴增程序為:94℃預變性5 min;94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃復性1 min，5 個循環;94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃復性1 min，35個循環;72℃延伸10 min;4℃結束保存。取 PCR產物3μL與3μL 6×Loding Buffer混勻，以1×TAE為電泳緩沖液，在含有0.5μg/mL溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠上電泳40min，恒壓100V，采用DL2000為marker，凝膠成像系統照像。

1.4.2 ITS 反應體系及程序

選用通用引物ITS1和ITS4(ITS1:5’－TCCGTAGGTGAACCTGC－3’;ITS4:5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC －3’)擴增5.8S rDNA及其兩側的ITS1和ITS2基因片段。PCR擴增反應在Bio－Rad iCycler thermal cycler上進行。反應體積為50μL，其成分為:模板:1μL，引物ITS 1和ITS 4(2×10－5mol/L)各 5μL(上海生工)，10×PCR 緩沖液(pH8.3)5μL，dNTP(0.01mol/L)4μL(TaKaRa)，Taq 酶(5U/μL)0.25μL(TaKaRa)，無菌雙蒸水定容至50μL。

ITS－PCR擴增條件:94℃預變性5 min;94℃1 min，54℃退火1 min，72℃延伸 1.5 min，循環 36 次，72℃延伸10min，產物于4℃保存。PCR擴增重復3次。

1.4.3 ITS 序列測定

采用PCR產物克隆測序，將PCR純化產物與pMD18－T Vector(TaKaRa)連接后轉化至大腸桿菌DH5a感受態細胞中，用含 X－Gal、IPTG、Amp的 LB平板進行藍白篩選，挑取白色菌落培養，進行菌落PCR檢測?？寺〕晒螅瑯悠肺猩虾Ｉど锕こ碳夹g服務有限公司測序。測序在ABI Prism 3730XL儀器上進行，測序試劑為BigDye Terminator v3.1，采用單向測序。

1.5 數據統計與分析

1.5.1 SRAP 數據統計與分析

電泳圖譜中每一條擴增帶均代表了引物與模板DNA互補的一對結合位點，可記為一個分子標記，有帶的記為1，無帶的記為0，進行統計稱0/1矩陣。利用NTSYS－pc(Version 2.10)軟件進行聚類分析并構建系統聚類圖。

1.5.2 ITS 系統發育樹的構建

根據Keller et al的方法查找ITS序列，序列的比對采用軟件 ClustalX 2.0。利用 BioEdit version 7.0.5 軟件進行人工調整。運用統計分析和系統發育分析軟件MEGA 4.1進行系統發育分析，以最大簡約法(Maximum Parsimony，MP)構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 引物篩選及擴增情況

從48對SRAP引物中篩選出9對引物，共擴增出88條，其中具有多態性條帶76條，占總帶數的84.6%，平均每對引物擴增出條帶9.7條，平均每對引物擴增出多態性條帶8.4條，平均多態性比例為76.8%。SRAP所檢測的9對標記在20個菌株中均具有明顯的多態性，但每個標記所顯示的多態信息含量不同。SRAP各標記的PIC變幅在0.048～0.918，以 ME3+EM2 引物組合的最高(0.918)，ME4+EM8引物組合最低(0.048)。絕大多數標記的PIC值大于0.5，而衡量多態信息量高低的指標一般認為PIC＞0.5 時，為高度多態位點［8］。平均 PIC 分別為 0.682，表明本研究所用菌株基因型豐富，遺傳多樣性較高，同時說明SRAP標記對黑木耳菌株具有較強的鑒別能力。

2.2 遺傳相似性分析

根據擴增產物的電泳帶型計算出SRAP標記20個菌株間遺傳距離為0.122～0.507，ITS序列分析表明20個菌株間遺傳距離為0.100～0.650，進一步說明了供試黑木耳菌株具有豐富的遺傳多樣性。對栽培菌株和野生菌株的遺傳距離參數進行比較發現，栽培菌株的遺傳距離及其變化范圍和變異系數均小于野生菌株，二者的平均遺傳距離差異達到顯著水平(P＜0.05)，說明野生菌株的遺傳基礎較寬，兩種分子標記均顯示野生菌株之間的遺傳距離(SRAP和ITS分別為0.405、0.368)大于栽培菌株間的遺傳距離(SRAP和ITS遺傳距離分別為0.339、0.320)，表明野生菌株遺傳多樣性優于栽培菌株。如表2所示。

表2 栽培品種與野生品種的遺傳距離參數Tab.2 Parameters of genetic distance between cultural and wild strains

2.3 構建遺傳進化樹

根據SRAP標記遺傳距離，采用NTSYS軟件對圖譜進行聚類分析(圖1)，ITS序列用最大簡約法構建系統發育樹(圖2)。在圖1中可以看出，在系數為0.61水平上，SRAP將20個菌株可以分為2類，不同類菌株間有親緣關系相對比較近的趨勢，如在系數為0.65的水平上1、2、4、5號栽培菌株相對親緣關系較近。個別野生菌株間親緣關系較近，如16號與17號之間遺傳相似系數為0.878。在圖2中可以看出，20個黑木耳菌株聚為2大類，3、4、5、6號與8個野生菌株聚為一類，1、2號與6個野生菌株聚為一類，同樣沒有表現出野生菌株與栽培菌株各自聚類的趨勢。黑木耳菌株栽培品種與野生菌株之間、野生菌株與野生菌株之間遺傳多樣性豐富，如3號(延明1號)與9號(LY)之間的遺傳距離為0.65，同為加格達奇地區采集菌株11號(64)與14號(JGDQ)之間遺傳距離為0.63，其余菌株相互間遺傳距離均在0.01～0.65。兩種方法所建聚類圖大體相似，均體現出菌株間遺傳多樣性比較豐富，因此可為黑木耳由野生菌株選育成為栽培菌株提供較好的育種材料，同時親緣關系遠近可以為菌株間原生質體育種提供理論依據。

圖1 SRAP標記遺傳關系的聚類圖Fig.1 Dendrogram of 20 Auricularia auricula strains generated by SRAP marker based on genetic distance

圖2 用MEGA4.1軟件分析的黑木耳系統樹Fig.2 MP tree of Auricularia auricula analysised by MEGA4.1

3 討論

目前國內外對野生黑木耳的種植資源研究處于空白狀態。黑木耳的研究熱點集中在國內人工栽培面積較大的幾十個菌種。本研究中所用的48對SRAP引物在20個菌株中所顯示的多態性不一致，18對引物多態性較低，21對引物多態性不穩定，9對引物能顯示出較高且穩定的多態性，平均PIC值0.682，較高的多態信息含量說明SRAP標記具有較高的鑒別能力，可作為一種很好的品種鑒定手段。13個野生菌株遺傳距離在0.0562～0.6937，高于李輝平研究中21個黑木耳菌株遺傳距離在0.36～0.55的結果［9］，說明野生菌株遺傳多樣性高于栽培菌株，可能是在人工育種過程中導致野生菌株部分遺傳信息消失造成的。通過對14個野生黑木耳菌株的序列分析表明，大興安嶺地區野生黑木耳菌株遺傳多樣性豐富，ITS區序列信息位點豐富，不同的野生黑木耳類群均有多個特異性的單核苷酸變異位點，當根據黑木耳的形態和性狀難以鑒別區分時，采用ITS序列對黑木耳屬資源評價和遺傳育種研究具有一定指導意義。從結果看，ITS和SRAP都能很好地對黑木耳進行聚類分析，而且產生的結果相似，說明兩者相結合能更好地用于黑木耳的遺傳多樣性分析。

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