多同位素內標氣相色譜-質譜法測定食品中4種氯丙醇含量

吳少明，傅武勝*，傅海慶，方勤美，華 娟

(1.福建省人獸共患病研究重點實驗室，福建省疾病預防控制中心，福建 福州 350001；2.福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002；3.福建農林大學金山學院，福建 福州 350002；4.福建省農業科學院生物技術研究所，福建 福州 350003；5.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002)

多同位素內標氣相色譜-質譜法測定食品中4種氯丙醇含量

吳少明1,2，傅武勝1,*，傅海慶3，方勤美4，華 娟5

(1.福建省人獸共患病研究重點實驗室，福建省疾病預防控制中心，福建 福州 350001；2.福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002；3.福建農林大學金山學院，福建 福州 350002；4.福建省農業科學院生物技術研究所，福建 福州 350003；5.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002)

采用多同位素內標法，結合七氟丁酰基咪唑(HFBI)衍生化的氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術，建立了食品中4種氯丙醇含量的檢測方法。對比了不同來源HFBI衍生試劑的作用性能，對定量內標物和校正標準的選擇進行了比較。結果表明：僅用2種同位素內標(3-氯-1,2-丙二醇-d5(或2-氯-1,3-丙二醇-d5)和1,3-二氯-2-丙醇-d5)校正，同樣可達到準確測定食品中4種氯丙醇含量的要求；若采用3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)為標準物定量測定2-氯-1,3-丙二醇(2-MCPD)時，所得2-MCPD結果偏低，僅為以2-MCPD為標準物定量結果(真實值)的52.1%～77.8%。在最佳條件下進行了方法學指標的系統驗證。4種氯丙醇的最低檢出限為2.5～10μg/kg；在100～2000ng范圍內，氯丙醇與內標物峰面積的比值和質量呈線性關系(R2＞0.9990)。以醬油和方便面調料粉為基質，進行100、200、400μg/kg三個水平的加標回收實驗，4種氯丙醇的回收率均值為90.1%～107%，相對標準偏差(RSD)為3.37%～10.4%(n=6)，均滿足痕量分析的要求。

食品；氯丙醇；基質分散固相萃取法；同位素稀釋技術；氣相色譜-質譜法

氯丙醇是某些食品中存在的一類化學污染物[1]，主要包括單氯取代的3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)與2-氯-1,3-丙二醇(2-MCPD)和雙氯取代的1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP)與2,3-二氯-1-丙醇(2,3-DCP)。3-MCPD具有生殖毒性和腎臟毒性，為潛在致癌物，1,3-DCP為動物遺傳毒性致癌物[2]，JECFA制定了3-MCPD的每日最大耐受劑量(PMTDI)為2μg/(kg bw?d)[3]，尚無其他3種氯丙醇的PMTDI值。氯丙醇為酸水解植物蛋白(HVP)生產中容易形成的污染物[4]，配制醬油、方便面調料粉等食品通常添加HVP以增加產品鮮味，由此造成這些食品氯丙醇的污染[5]。許多國家已對HVP、醬油等食品制定了氯丙醇的限量標準。2012年開始，我國規定固態、液態調味品(含配制醬油等) 3-MCPD須分別低于1.0、0.4mg/kg[6]，歐盟甚至要求低于0.02mg/kg[7]，這對氯丙醇的檢測提出了很高的要求。

目前的檢測方法主要針對氯丙醇中的3-MCPD和(或)1,3-DCP[8-19]，國際公認的方法為穩定性同位素稀釋氣相色譜-質譜聯用法[4,8,10,15,19]。但食品中可能還伴隨著另外兩種氯丙醇(2-MCPD和2,3-DCP)的存在[20]，由于2-MCPD與3-MCPD、1,3-DCP與2,3-DCP互為同分異構體，因此它們可能具有相似的毒性作用，這使得研究同時準確測定4種氯丙醇的方法成為必要。而目前僅見少量文獻[21-22]報道以d5-3-MCPD、d5-1,3-DCP為校正內標，同時測定醬油等食品中的4種氯丙醇。但氯丙醇的化學性質存在差異，僅用2種內標是否可準確測定4種氯丙醇，還需進一步驗證。此外，以3-MCPD為標準物測定2-MCPD的含量可能不準確[23]。因此，本實驗以4種氯丙醇各自對應的同位素(4種)為內標，建立同時測定食品中4種氯丙醇的方法，同時評估了內標物和標準物對測定結果準確性等指標的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀造醬油和方便面調料粉購自福州當地超市。

3-氯-1,2-丙二醇(CAS號：96-24-2)、2,3-二氯-1-丙醇(CAS號：616-23-9)、3-氯-1,2-丙二醇-d5(同位素純度97%)、1,3-二氯-2-丙醇-d5(同位素純度98%)、2,3-二氯-1-丙醇-d5(同位素純度98%) 美國Aldrich公司；2-氯-1,3-丙二醇(CAS號：497-04-1)、2-氯-1,3-丙二醇-d5(同位素純度98%) 加拿大TRC公司；雙氯取代的1,3-二氯-2-丙醇(CAS號：96-23-1) 德國Fluka公司；氯化鈉、無水硫酸鈉(560℃烘烤6h后使用)、無水乙醚(經重蒸餾后使用)(均為分析純) 中國國藥集團上海化學試劑公司；硅藻土(編號29111) 美國Agilent公司；正己烷(色譜純) 美國Fisher公司；異辛烷(色譜純) 英國Pooled公司；七氟丁酰基咪唑(HFBI)購自Regis、TCI、Addams、Sigma、Alfa等公司以及實驗室合成；聚丙烯固相萃取柱(45mL/支)福州勤鵬生物技術公司。

1.2 儀器與設備

3800型氣相色譜儀和Saturn2000型質譜儀 美國Varian公司；DB-5MS毛細管柱(30m×0.25mm，0.25μm)美國Agilent公司；G-560E型漩渦混合器 美國Scientific Industries公司；KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏試驗設備公司；DFY40型搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械公司；TM-0912P型馬弗爐 北京盈安美誠科學儀器公司；CP225D型電子天平(準確至0.01mg，用于稱量標準品) 德國Sartorius公司；YP202型電子天平 上海精密科學儀器公司；EYELA型旋轉蒸發儀 日本東京理化公司；0.5mL氣密針 美國Hamilton公司；移液器4把(最大量程分別為20、100、200μL和1000μL) 法國Gilson公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液與標準曲線制備

標準儲備液：分別準確稱取0.5～1.0mg各氯丙醇及內標標準品于8支10mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解、定容至刻度線，充分混勻得到質量濃度為0.1mg/mL的標準和內標儲備液，于－24℃冰箱中放置。

標準中間液：取適量上述標準儲備液于同一支10mL容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，得到質量濃度為20μg/mL的混合標準中間液。按照同樣方法，配制混合內標中間液。

標準工作液：取適量上述標準中間液用正己烷稀釋，配制4.0?g/mL的混合標準工作液；同樣取上述內標中間液適量，以正己烷稀釋定容至10mL，得到4.0?g/mL的混合內標工作液。

標準系列：分別取上述標準工作液25、50、125、250、500μL于5支5mL玻璃試管中，并加入75μL混合內標工作液(4.0?g/mL)，然后補加正己烷至體積約為1.0mL，制得氯丙醇質量濃度為100、200、500、1000、2000ng/mL的標準系列。此系列溶液經HFBI衍生后，以GC-MS進樣分析。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 加入內標

醬油等液體樣品：稱取3.0g樣品于50mL塑料離心管中，加入75μL混合內標溶液(4.0?g/mL)，超聲5min，混勻后待凈化用。調料粉樣品：稱取1.0g高速粉碎均勻的樣品于15mL塑料離心管中，加入75μL混合內標溶液(4.0?g/mL)，然后加入4.0g飽和氯化鈉溶液，超聲5min，使粉末充分分散于液體中，混勻后以5000r/min的轉速離心5min，將上層溶液轉移至50mL塑料離心管中，待凈化用。

1.3.2.2 基質分散固相萃取凈化

于上述溶液中加入3.0g硅藻土，拌勻后，將其全部轉入預先裝有1.5g硅藻土的固相萃取柱中。先以30mL正己烷淋洗，棄去淋洗液，再以80mL重蒸無水乙醚分3～4次加入萃取柱中，洗脫氯丙醇，流速不超過8mL/min，洗脫液以預先裝有約10g無水硫酸鈉的250mL三角瓶收集。洗脫結束后，每隔10min振搖三角瓶，以打散結塊的硫酸鈉，最大程度脫除洗脫液中的水分。

1.3.2.3 濃縮

將上述經充分脫水的洗脫液轉入250mL雞心瓶中，再以10mL正己烷洗滌無水硫酸鈉層，洗液一并轉入雞心瓶中。溶液減壓濃縮至約0.5mL，并小心將之轉移至5.0mL磨口玻璃刻度試管中，再用少量正己烷洗滌雞心瓶2～3次，洗液一并轉入試管中，至體積約為1.2mL，供衍生用。

1.3.2.4 衍生

于上述盛有濃縮液或標準液的刻度試管中，快速加入50μL HFBI衍生試劑，迅速蓋上磨口塞并渦旋混勻，于75℃恒溫烘箱中保溫15min后，逐一檢查每一試管，如發現試管內液體少于0.8mL，則補加正己烷至1.2mL，并在75℃條件下繼續加熱15min。反應結束后，取出試管，待其冷卻至室溫后，用異辛烷定容至1.0mL，并加入2mL飽和氯化鈉溶液，充分渦旋，使得下層液體澄清。靜置后，取上層液體于事先裝有約0.3g無水硫酸鈉的2mL進樣瓶中，供GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：DB-5MS毛細管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；進樣口溫度：280℃；程序升溫條件：50℃保持1min，再以2℃/min的速度升至78℃，最后以30℃/min的速度升至300℃，保持5min；載氣：高純氦，流速0.8mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣體積：1μL。質譜條件：電子電離(electron ionization，EI)源；電子倍增器增益：＋250V；燈絲電流：100μA；阱溫：230℃；傳輸線溫度：250℃；歧盒溫度：50℃；溶劑延遲：3min；質譜采集時間：3～29min；掃描質量數范圍：m/z 90～300；掃描速率：0.65s/次。

2 結果與分析

2.1 定量離子的選擇

將質量為5000ng的氯丙醇及其同位素內標物標準液單獨衍生，對衍生物進行全掃描。3-MCPD、2-MCPD的m/z 253的靈敏度最高，m/z 289、m/z 453次之，文獻大多采用m/z 253定量[10,13,15-17]3-MCPD，但在本體系中，以m/z 253得到的提取離子色譜圖，在待測目標物處有明顯的干擾峰，因此選擇m/z 289作為3-MCPD、2-MCPD的定量離子；d5-3-MCPD與d5-2-MCPD均采用m/z 257；1,3-DCP采用m/z (275＋277)靈敏度明顯優于文獻[10,13,15-17]的m/z 275定量，對于其同位素內標d5-1,3-DCP，則采用m/z (278＋280)定量；2,3-DCP以m/z (75＋77)同樣優于文獻[15]的m/z 75，d5-2,3-DCP則采用m/z 79。表1列舉了氯丙醇及其內標的監測離子和定量離子，提取離子色譜圖見圖1。

圖1 氯丙醇及其內標衍生物提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the derivatives of chloropropanols and internal standards

表1 氯丙醇及其內標衍生物的監測離子和定量離子Table1 Quantitation and monitoring ions for the derivatives of chloropropanols and internal standards

2.2 HFBI衍生試劑性能對比

表2 不同品牌HFBI衍生后氯丙醇峰面積的對比((n=3)Table2 Comparison of the peak areas of chloropropanols and internal standards after derivatized by different brands of HFBI (

以醬油為基質，加入氯丙醇混合標準液和對應的內標混合液各600ng，按1.3.2節進行預處理，洗脫液濃縮至約7mL。準確移取6份于編號的5mL刻度試管中，每份體積為1.0mL，分別加入50μL不同品牌的HFBI衍生試劑，衍生液用GC-MS進樣分析，每個條件重復實驗3次，結果見表2。對比6種品牌HFBI的衍生作用，同一目標物質的峰面積(響應)相差不大，3次重復測定結果的相對標準偏差(RSD)在1.1%～6.1%之間，但實驗室合成HFBI產品與TCI公司HFBI衍生時目標物響應稍低。比較不同衍生劑，對于每一氯丙醇，其與對應內標峰面積的比值均較為接近，RSD為1.2%～2.2%。Regis公司產品衍生后氯丙醇峰形最好，而實驗室合成衍生劑產品氯丙醇峰形略差。從包裝上看，Regis公司產品瓶口采用橡膠塞密封，更有利于氣密針穿刺取液，而且潮氣不易進入試劑瓶內，使衍生操作更簡便，且該公司產品價格也較低，本實驗選用Regis公司HFBI試劑。

2.3 同位素內標的使用和選擇

2.3.1 同位素內標的使用

將氯丙醇標準及其同位素內標加入到20% NaCl溶液中，按照1.3.2節樣品前處理步驟進行操作。若采用外標法計算氯丙醇的結果，并與以正己烷為介質的相同質量的標準液衍生物進行比較，4種氯丙醇的絕對回收率僅為35.2%～59.1%；而采用內標法計算時，其相對回收率則為91.2%～106%，滿足測定要求。此外，在對醬油以及方便面調料粉進行加標實驗時，單氯丙醇及其內標的絕對回收率僅為38.1%～56.5%，而雙氯丙醇及其內標的回收率更低，僅為6.34%～15.3%。由此可見，采用本實驗操作步驟，必須使用內標法才可獲得準確可靠的結果。

2.3.2 同位素內標的選擇

表3 內標物對測定結果的影響((n=6)Table3 Effect of internal standards on analysis results (n==66))

表4 定量標準對加標醬油和方便面調料粉樣品中2-MCPD含量的影響Table4 Effect of calibration standard of 3-MCPD and 2-MCPD on 2-MCPD content in spiked soy sauce and instant noodle seasoning powder

之前，由于國際上缺乏2-MCPD標準品和d5-2-MCPD和d5-2,3-DCP內標標準品出售，因此文獻[19,21-22]方法僅以d5-3-MCPD和d5-1,3-DCP為內標物校正3～4種氯丙醇，因此所測得結果可能不夠準確，需要對此予以重新評估。本實驗以市售釀造醬油和方便面調料粉為基質，進行3種水平(100、200μg/kg和400μg/kg)的加標回收實驗，結果見表3。當以d5-3-MCPD或d5-2-MCPD作為單氯丙醇的定量內標時，單氯丙醇的回收率為86.9%～107%，RSD為3.37%～11.4%，皆滿足痕量分析的要求。這說明d5-3-MCPD或d5-2-MCPD皆可作為單氯丙醇(3-MCPD和2-MCPD)測定的定量內標。以d5-1,3-DCP作為雙氯丙醇的定量內標時，目標物(1,3-DCP和2,3-DCP)的回收率均較為理想，在83.1%～101%之間，RSD為5.62%～11.5%。以d5-2,3-DCP作為雙氯丙醇的定量內標時，2,3-DCP的回收率和RSD分別為90.6%～103%、4.79%～9.36%，滿足要求；而1,3-DCP的回收率僅為36.2%～73.2%，RSD高達17.1%～61.5%。這說明僅d5-1,3-DCP可作為2種雙氯丙醇測定的定量內標，而d5-2,3-DCP作為1,3-DCP的定量內標時，所得結果不滿足要求。

2.3.3 2-MCPD測定時標準物的對比

之前，由于國際上缺乏商品2-MCPD標準品出售，文獻[22]報道以3-MCPD的標準曲線計算2-MCPD的含量。由于不同物質的響應不同，以此方法所得2-MCPD含量可能不夠準確。因此需要對該法的可靠性重新進行驗證。在上述醬油和方便面調料粉氯丙醇加標回收實驗中，采用2-MCPD、3-MCPD兩條標準曲線計算、對比2-MCPD的含量，并以2-MCPD為標準曲線測定結果作為真值進行評價，結果見表4。以3-MCPD標準曲線計算所得2-MCPD結果均偏低，釀造醬油、方便面調料粉中，以3-MCPD為標準曲線計算所得2-MPCD含量分別為真值的52.6%～77.8%、52.1%～63.1%，均不滿足測定的準確度要求。因此為了精確定量，必須以2-MCPD為標準物計算2-MCPD的含量。

2.4 方法學指標的考察

2.4.1 檢出限和定量限

表5 氯丙醇的檢出限和定量限、線性回歸方程Table5 Regression equation, and detection and quantification limits of chloropropanols

如表5所示，在醬油基質與方便面調料粉基質中，4種氯丙醇的檢出限(LOD，RSN=3)在2.5～10μg/kg之間，定量限(LOQ，RSN=10)為8.0～33μg/kg。由于雙氯取代氯丙醇極性較單氯取代氯丙醇更小，在基質分散固相萃取(SPE)中，部分被正己烷淋洗造成靈敏度損失，因此其LOD和LOQ為單氯取代氯丙醇的2～3倍，但均滿足食品中痕量氯丙醇的分析要求。

2.4.2 線性范圍

以氯丙醇與各自內標物峰面積的比值Y和氯丙醇質量X(ng)計算線性回歸方程。在最優條件下進行方法學驗證實驗，在100～2000ng范圍線性關系良好，相關系數R均大于0.9990(表5)，滿足分析要求。

2.4.3 精密度和準確度

以醬油和方便面調料粉(12種常見品牌方便面調料粉混勻)為基質，在最優條件下進行100、200、400μg/kg三個水平的加標回收實驗，每個水平重復6次。結果如表3所示，分別以各自對應的同位素內標校正時，4種氯丙醇的回收率均為90.1%～107%，RSD為3.37%～10.4%，重復性(精密度)和準確度均較為理想，滿足痕量分析的要求。

2.5 實際樣品分析

利用本方法調查了市售8種品牌方便面調料粉和7種品牌醬油氯丙醇的含量。結果表明，均未檢出雙氯丙醇(小于LOD)；方便面調料粉和醬油樣品各有一份檢出單氯丙醇，方便面調料粉中3-MCPD、2-MCPD含量分別為0.97、0.05mg/kg，醬油中3-MCPD、2-MCPD含量分別為1.3、0.11mg/kg。3-MCPD含量超過我國限量要求(固態和液態分別為1.0、0.4mg/kg)，均高于歐盟的限量值(0.02mg/kg)。

3 結 論

采用多同位素內標法，結合基質分散固相萃取法(MSPD)，以氣相色譜-質譜法測定，建立了同時測定醬油和方便面調料粉中4種氯丙醇含量的方法。該方法明顯較GB/T 5009.191—2006《食品中氯丙醇含量的測定》法簡便，減少了取樣量和硅藻土、有機溶劑的消耗，靈敏度基本一致，精密度和準確性得到了進一步提高，并將該方法成功應用于實際樣品的分析。結果表明僅需2種內標(d5-1,3DCP和d5-3-MCPD或d5-2-MCPD)即可達到食品中4種氯丙醇準確定量的目的。同時若以3-MCPD標準曲線定量2-MCPD值時，2-MCPD僅為真實值的52.1%～77.8%。

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Determination of 4 Kinds of Chloropropanols in Foods by Gas Chromatography-Mass Spectroscopy Coupled with Multi-Isotopic Internal Standard Technique

WU Shao-ming1,2，FU Wu-sheng1,*，FU Hai-qing3，FANG Qin-mei4，HUA Juan5

(1. Fujian Provincial Key Laboratory of Zoonosis Research, Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou 350001, China；2. Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality, Fuzhou 350002, China；3. College of Jinshan, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China；4. Biotechnology Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China；5. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

An analytical method was developed to determine 4 kinds of chloropropanols in foods using gas chromatography mass spectrometer coupled with the multi-isotopic internal standard technique. The performance difference between different brands of HFBI as a derivativization reagent and internal standard selection for quantification were discussed. Under the optimal conditions, the limits of detection (LOD) were 2.5–10 μg/kg for 4 kinds of chloropropanols. According to the internal standard calibration, an excellent linearity between 100 ng and 2000 ng of chloropropanols (R2 ＞ 0.9990) was obtained. When chloropropanols were spiked at levels of 100, 200, 400 mg/kg in soy sauce and seasoning powder of instant noodles, the average recovery rates were 90.1%–107%, with relative standard deviation (RSD) of 3.37%–10.4% (n = 6). The application of only 2 kinds of internal standards (chloropropane-1,2-diol-d5or 2-chloropropane-1,3-diol-d5and 1,3-dichloro-2-propanol-d5) can reveal accurate and precise determination for 4 kinds of chloropropanols. When 3-chloropropane-1,2-diol (3-MCPD) was used to calibrate 2-MCPD in foods, the level of 2-chloropropane-1,3-diol (2-MCPD) was only 52.1%–77.8% of the real content.

O657

A

1002-6630(2013)18-0131-06

10.7506/spkx1002-6630-201318026

2013-06-11

國家自然科學基金面上項目(81172671)；衛生部公益性行業科研專項(200902009)；福建省杰出青年基金項目(2011J06011)；福建省醫學創新課題(2011-CX-21)

吳少明(1986—)，男，檢驗員，碩士，研究方向為食品檢測。E-mail：280257959@qq.com

*通信作者：傅武勝(1971—)，男，主任技師、副教授，博士，研究方向為污染物化學與食品安全。E-mail：fwsfqm@126.com

Key words：food；chloropropanol；dispersion matrix solid-phase extraction；isotopic internal standard technique；gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS)