TaqMan探針雙重熒光PCR法檢測副溶血性弧菌

許龍巖，袁慕云，曹際娟，凌 莉

(1.廣東出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001)

TaqMan探針雙重熒光PCR法檢測副溶血性弧菌

許龍巖1，袁慕云1，曹際娟2，凌 莉1

(1.廣東出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001)

目的：建立同時檢測副溶血性弧菌(VP)和其毒力基因的方法。方法：根據VP的toxR基因和tdh基因，分別設計引物和探針，建立基于TaqMan探針雙重熒光聚合酶鏈式反應擴增體系，進行特異性、敏感性實驗，并用建立的方法檢測從廣東地區和遼寧地區進出口食品中分離的VP菌株的毒力基因分布情況。結果：VP標準菌株和3株從食物中毒病人中分離株均出現toxR基因和tdh基因擴增曲線，而31株包括溶藻弧菌、單增李斯特菌等弧菌屬和腸桿菌科的菌株擴增結果呈陰性；敏感性實驗結果表明，VP濃度與Ct值有很好的反向的線性關系，toxR和tdh線性方程的R2分別為0.999、0.997，最低檢測濃度達到3.6×102CFU/mL ；檢測食品中分離的37株VP只出現toxR基因擴增曲線，未見tdh基因擴增曲線，表明37株VP分離株均未帶tdh毒力基因。結論：建立的方法特異性好、靈敏度高，可用于食品中VP的特異性及毒力基因檢測。

副溶血性弧菌；toxR基因；tdh基因；TaqMan探針；雙重熒光聚合酶鏈式反應；檢測；食品

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一種重要的食源性病原菌，其引發的食源性疾病暴發是當前面臨的公共衛生問題之一[1]。臨床上分離的VP絕大多數可在一種特殊的血瓊脂培養基上產生β型溶血，稱為神奈川現象(kanagawa phenomenon，KP)，KP是鑒定致病性和非致病性VP菌株的一項重要指標，日本學者認為VP的KP現象與腸道致病性有著密切的關系。β型溶血反應是由VP產生的耐熱的直接溶血毒素(TDH)所造成，它由tdh基因編碼，是副溶血性弧菌致病的主要毒力因子[2-3]。檢測tdh基因對判斷VP有無致病性非常實用，但tdh基因家族廣泛存在于人類致病性弧菌中，如大多數霍利斯弧菌，某些擬態弧菌等，因此，僅用tdh檢測VP存在一定的局限性[4-6]。以tlh為靶基因也可能出現同樣的情況，Robert-Pillot[7]、楊梅[8]等的研究發現，溶藻弧菌和副溶血性弧菌的同源性達60%～70%，靶定tlh基因的引物不能用于兩者的鑒別。Croci等[9]評估了不同靶基因的副溶血性弧菌的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)法，指出toxR作為靶基因的PCR具有最高的準確性，該基因可作為VP分子鑒別的參考方法。本研究以VP的toxR基因和tdh基因為目的基因，分別設計引物和探針，以期建立基于TaqMan探針的雙重熒光PCR法同時檢測VP和其毒力基因的方法，并分析VP菌株毒力基因tdh的攜帶情況。AB063113)和tdh基因序列(序列號：BA000032)中的保守區域，用Oligo 5.0軟件設計引物和TaqMan探針，委托寶生物工程(大連)有限公司合成。熒光PCR引物、探針和普通PCR引物序列見表1。

表1 熒光PCR引物、TTaaqqMan探針和普通PCR引物序列Table1 Fluorescence PCR primers,TTaaqqMan probes and one common PCR primer sequence

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于本研究的VP菌株共41株，其中標準菌株1株，編號為ATCC 33847，VP食物中毒患者分離株3株，編號分別為VP1、VP2、VP3，廣東地區進出口食品中分離的VP 21株，編號為GD1～GD21，遼寧地區進出口食品中分離的VP 16株，編號為LN1～LN16；非VP弧菌屬菌株19株，其中標準菌株4株，分別為溶藻弧菌CGMCC 1.1833、海蛹弧菌CGMCC 1.1623、弗氏弧菌CGMCC 1.1613、最小弧菌CGMCC 1.1969，15株水產品中的分離株，分別為溶藻弧菌3株、創傷弧菌2株、霍利斯弧菌3株、最小弧菌3株、霍亂弧菌2株、塔式弧菌2株；腸桿菌科菌株12株，分別為單增李斯特菌ATCC 19115、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、阪崎腸桿菌ATCC 29544、大腸桿菌ATCC 25922、沙門氏菌CMCC 50071、鮑氏志賀氏菌CMCC 51582、宋內氏志賀氏菌CMCC 51334、痢疾志賀氏菌NICPBP 51252、福氏志賀氏菌NICPBP 51571、小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC 52221、假結核耶爾森氏菌CMCC 53510、肺炎克雷伯氏菌CMCC 46102。上述菌株來自中國普通微生物菌種保藏管理中心、中國科學院南海水產研究所、遼寧出入境檢驗檢疫局技術中心和廣東出入境檢驗檢疫局技術中心。所有菌株均經VITEK2和API試劑條進行確證。

Buffer、dNTP、ROX、Taq酶、瓊脂糖、PCR分子質量標記(50～500bp) 寶生物工程(大連)有限公司；堿性蛋白胨水 北京陸橋有限公司。

1.2 儀器與設備

7900實時熒光PCR儀 美國ABI公司；核酸提取儀日本PSS公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針設計

根據GenBank公布的VP toxR基因(序列號：

1.3.2 模板DNA的制備

所有菌株均用3%氯化鈉堿性蛋白棟水37℃培養10h，取1mL菌懸液，12000r/min離心5min去上清液，用1mL去離子水漂浮沉淀，12000r/min離心3min去上清液，重復2次，最后加200μL去離子水在核酸提取儀上提取DNA，用于熒光PCR擴增。

1.3.3 PCR擴增體系及反應參數

1.3.3.1 雙重熒光PCR擴增體系

反應體系共30μL：模板DNA 2μL、TaqMan緩沖液5μL、5mmol/L MgCl24μL、2.5mmol/L dNTPs 2μL、20μmol/L TaqMan探針各1μL(共2μL)、20μmol/L引物各1μL(共4μL)、UNG酶(0.55U)0.2μL、Taq聚合酶3μL、去離子水7.8μL。熒光PCR反應參數為95℃ 30s、93℃ 5s、60℃ 30s，40個循環。

1.3.3.2 普通雙重PCR擴增體系和反應條件

反應體系共50μL：10×PCR Buffer(含Mg2+)5μL、dNTPs 4μL (每種dNTP的終濃度均為0.2mmol/L)、引物各2μL(共8μL，每種引物終濃度為0.2μmol/L)，模板DNA 2μL、Taq酶0.25μL、去離子水30.75μL。

PCR循環參數為95℃、30s，94℃、30s、55℃、30s、72℃、1min，30個循環，72℃延伸10min，取PCR產物及核酸分子質量參照物，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。

1.3.4 特異性實驗

VP標準菌株1株、40株VP分離株，VP1～VP3、GD1～GD21、LN1～LN16，31株溶藻弧菌、單增李斯特菌等弧菌屬和腸桿菌科的菌株，提取DNA后按雙重熒光PCR反應體系進行熒光PCR擴增。

1.3.5 雙重熒光PCR敏感性實驗及標準曲線

經平板菌落計數原始濃度為3.6×107CFU/mL的VPATCC 33847培養液進行10倍梯度稀釋，從每個稀釋度中取1mL培養液提取DNA，按照雙重熒光PCR反應體系進行敏感性實驗。在熒光PCR儀上選擇標準品模式，儀器自動繪制標準曲線。

1.3.6 普通雙重PCR

用VP標準菌株1株，VP1～VP3為模版，以toxR和tdh為目的基因，按照普通雙重PCR擴增體系進行PCR擴增，擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.7 PCR結果判斷

1.3.7.1 熒光PCR結果判定

熒光PCR檢測擴增曲線指數期明顯，Ct值小于35可直接判定為陽性。Ct值在35～37之間判斷為可疑，需要加大模板量進行重復實驗，若擴增曲線指數期明顯判定為陽性，否則為陰性。

1.3.7.2 普通PCR結果判定

有符合預期長度且電泳條帶明顯者判定為陽性，不符合預期長度或者條帶不明顯者判定為陰性。

1.3.8 VP模擬樣品檢測

用均質帶分別稱取25g對蝦、帶魚、三文魚、魷魚，分別加入1mL已調好濃度的3.6×102CFU/mL VP ATCC 33847菌懸液，每份樣品加入225mL堿性蛋白凍水，用拍打器拍打2min，37℃培養10h。從樣品液面分別吸取1mL增菌液提取DNA，按照VP熒光PCR反應體系和反應參數進行熒光PCR擴增。另一部分按照GB 4789.7—2008《食品衛生微生物學檢驗：副溶血性弧菌檢驗》進行檢測。

2 結果與分析

2.1 VP雙重熒光PCR特異性實驗

以VP的toxR基因與tdh基因為目的基因，按VP雙重熒光PCR反應體系進行PCR擴增，不同探針顏色在儀器上可以選擇，選擇FAM探針會出現該探針標記的曲線，選擇all時會出現所有探針的曲線。VP ATCC 33847、VP1、VP2、VP3，4株菌株分別擴增出指數期明顯的toxR與tdh基因擴增曲線，而溶藻弧菌、單增李斯特菌等31株菌株擴增結果呈陰性(圖1)。常規雙重PCR結果，VPATCC 33847、VP1、VP2、VP3均出現與預期相符的擴增片段(圖2)，表明上述4株VP均有toxR和tdh目的基因，結果與熒光PCR結果相同。廣東地區分離的21株VP和遼寧地區分離的16株VP熒光PCR結果中，只有toxR擴增曲線指數期明顯，Ct值在10～20之間，而tdh擴增結果呈陰性，提示廣東地區和遼寧地區食品中分離的37株VP均未攜帶tdh基因(圖3、4)。

2.2 VP敏感性實驗

VP菌液濃度與toxR、tdh兩個基因Ct值之間有較好的線性關系(圖5)，toxR和tdh的R2分別為0.999、0.997，菌液濃度y(CFU/mL)與Ct值x之間的反向線性關系表達式分別為y=-4.04x＋44.04、y=-4.01x＋43.67。

2.3 模擬樣品檢測

模擬樣品熒光PCR檢測結果，4份樣品均出現toxR與tdh擴增曲線，按照GB 4789.7—2008的4份樣品也分別分離鑒定出VP，結果與熒光PCR方法一致。

圖2 VP普通雙重PCR電泳圖Fig.2 Electrophoresis of duplex PCR products from VP

圖3 廣東地區21株VP分離株熒光PCR擴增圖Fig.3 PCR amplification of 21 wild VP strains from Guangdong area

圖4 遼寧地區16株VP分離株熒光PCR擴增圖Fig.4 PCR amplification of 16 wild VP strains from Liaoning area

圖5 VP雙重熒光PCR敏感性實驗擴增圖Fig.5 Sensitivity of duaplex PCR amplification for VP

3 討 論

副溶血弧菌是一種引起食源性疾病的重要病原，在近年來沿海地區的食物中毒病例中，該菌已成為首要病原[10-11]。副溶血性弧菌的致病機理復雜且多樣化，不含毒力因子的菌株不一定致病，而傳統的培養鑒定法短時間內無法確定該菌的毒力強弱，還需繼續增加其他特殊的生化等鑒定實驗，這無疑使鑒定周期更加漫長[12]。因此，研究一種快速檢測VP的同時也能獲得其毒力基因分布等多重信息的檢測方法具有重要意義。本研究以toxR基因和毒性基因tdh基因為目的基因，分別設計引物和TaqMan探針，反復優化反應體系建立基于TaqMan探針的雙重熒光PCR檢測VP同時檢測其毒力基因的方法。用toxR基因擴增特異性檢測VP，tdh基因擴增檢測VP是否攜帶tdh基因，在一次擴增反應不僅能特異性檢測VP，而且可從基因水平判斷其致病性及毒力強弱，達到簡便、快速、準確可靠的目的。

多重熒光PCR是單重熒光PCR技術基礎上發展的技術，需在反應體系中添加多對引物和探針，而且要優化引物濃度、模板濃度、退火溫度、延伸時間、循環次數等諸多復雜因素。其中，引物和探針設計是一個關鍵環節，如能在引物設計這一關鍵環節避免非特異擴增反應的發生，就有可能顯著提高實驗效率[13-15]。本研究在設計引物和TaqMan探針時，為了引物和探針的特異性以及兩對引物和探針之間互不干擾，用NCBI上的BLAST功能反復比對、篩選設計的引物和探針，通過DNAStar軟件分析確認兩對引物、探針之間不形成二聚體，而且盡量使兩對引物之間和兩個TaqMan探針之間的Tm值盡量接近(表1)，以上措施保證了擴增產物的特異性及同時擴增目的片段。值得一提的是，相同濃度的熒光PCR反應體系中，VP ATCC 33847、VP1、VP2、VP3，4株菌株tdh的擴增曲線均滯后于toxR出現，即tdh的Ct值始終大于toxR的Ct值，在VP基因組中toxR基因的拷貝數是否高于tdh的拷貝數有待進一步研究。37株VP分離株檢測結果表明，所有菌株只擴增出toxR基因，而tdh基因擴增結果呈陰性，表明廣東地區和遼寧地區進出口食品中VP分離株未攜帶tdh基因。日本學者研究來自海產品及海水的VPtdh基因的攜帶率僅1%[16]，ISO/TS 21872-1—2007中也提示環境中分離的VP tdh攜帶率在1%左右[17]。本研究VP分離株tdh攜帶率為0%，結果低于上述統計結果，這可能與本研究用VP菌株來源和分離年代不同、菌株數量較少等原因有關。

副溶血性弧菌是好氧菌，樣品在增菌液中培養時，離液面越近越混濁，大多數情況下還形成菌膜。因此，取增菌液提取DNA時，盡量取增菌液的表面，可增加VP的菌量又可以稀釋樣品中對熒光PCR產生干擾的成分，提高擴增反應的靈敏度[18]。本研究模擬樣品檢測結果，熒光PCR方法與傳統檢測方法一致，但在檢測周期上傳統方法需要培養、劃線分離、生化鑒定、神奈川試驗等，需要4～5d，而熒光PCR方法，增菌10h、核酸提取和熒光PCR反應3～4h，整個實驗可在13～14h完成，簡便快捷。

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Detection of Vibrio parahaemolyticus Using Duplex Fluorescence Real-Time PCR with TaqMan Probe

XU Long-yan1，YUAN Mu-yun1，CAO Ji-juan2，LING Li1
(1. Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510623, China；2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116001, China)

Objective: To establish a specific method for the detection of Vibrio parahaemolyticus (VP) and its virulence gene. Methods: Based on the sequences of toxR (transmembrane transcription activator) and tdh (thermostable direct hemolysin) genes from VP, specific primers and TaqMan probes were designed and a duplex fluorenscencet real-time PCR amplification system was established. The specificity and sensitivity of this method were evaluated. Moreover, the distribution of virulence gene in import and export foods from Guangdong and Liaoning provinces was investigated by this method. Results: The specificity tests showed that both toxR and tdh genes were amplified through the DNAs of standard strain, ATCC33847, and 3 wild strains isolated from food-poisoning patients. However, no specific amplification curves were observed for 31 other strains tested, including Vibrio alginolyticus and L. monocytogenes both from the genus Vibrio and Enterobacteriaceae. The sensitivity results demonstrated an inverse linear relationship between VP concentration and Ct values. The linear coefficients (R2) for toxR and tdh were 0.999 and 0.997 with an identical LOD of 3.6 × 102CFU/mL, respectively. Furthermore, the detection results revealed that toxR gene of all 37 foodborne VP wild strains in this study were positive for toxR gene, but all of them were negative for tdh gene, indicating that the genomes of 37 wild strains contained toxR gene, but did not contain tdh virulence gene. Conclusion: A rapid, sensitive and specific method suitable for the simultaneous detection of species and virulences specific genes of VP in foods has been established in this study.

Vibrio parahaemolyticus；toxR gene；tdh gene；TaqMan based probe；duplex fluorescence real-time PCR；detection

Q939.93

A

1002-6630(2013)18-0263-04

10.7506/spkx1002-6630-201318054

2012-10-15

許龍巖(1970—)，男，高級工程師，碩士，研究方向為食品微生物分子檢測。E-mail：xlyooo@sohu.com