響應面優化海藻酸鈉回收馬鈴薯淀粉生產廢水中蛋白質的工藝

劉婷婷，姚 佳，張飛俊，王大為*

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

響應面優化海藻酸鈉回收馬鈴薯淀粉生產廢水中蛋白質的工藝

劉婷婷，姚 佳，張飛俊，王大為*

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

采用海藻酸鈉作為絮凝劑回收馬鈴薯淀粉廢水中的蛋白質，并對其氨基酸組成進行分析。在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken試驗設計與響應面分析方法，選取海藻酸鈉添加量、pH值、絮凝溫度、攪拌時間4個因素，以馬鈴薯蛋白質回收率作為響應值，優化海藻酸鈉回收馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質的工藝參數。結果表明：海藻酸鈉回收馬鈴薯蛋白質的最佳工藝參數為海藻酸鈉添加量0.97g/L、絮凝溫度35℃、攪拌時間35min、pH3.6，此條件下馬鈴薯蛋白質回收率為70.93%；氨基酸分析結果表明：回收的馬鈴薯蛋白質總氨基酸含量為69.43%，其中必需氨基酸含量為28.00%，占總氨基酸含量的40.33%，色氨酸為第一限制性氨基酸。

海藻酸鈉；馬鈴薯淀粉；廢水；蛋白質

馬鈴薯是世界上僅次于小麥、水稻和玉米的第4大糧食作物，我國馬鈴薯種植面積已達到670萬公頃，約占世界總面積的25%，成為馬鈴薯生產第一大國[1-2]。我國馬鈴薯加工制品主要是淀粉類產品，加工過程中首先要分離出馬鈴薯淀粉，平均每生產1t馬鈴薯淀粉，需排放5t左右生產廢水，廢水中主要的成分是蛋白質，直接排放不但會造成資源浪費，還會帶來環境污染問題[3-5]。馬鈴薯蛋白質是一種全價蛋白，營養價值優于大多數植物蛋白質，與牛奶蛋白和雞蛋蛋白相當，功效比值(protein efficiency ratio，PER)達到2.3[6-7]，馬鈴薯蛋白質中2/3為球蛋白[8]，其氨基酸組成均衡，含有人體所需的8種必需氨基酸[9]，特別是賴氨酸含量較高，可以彌補谷物蛋白賴氨酸的缺乏。因此，回收馬鈴薯淀粉生產廢水中的蛋白質，使其變廢為寶，不僅可以解決馬鈴薯淀粉生產廢水直接排放的污染問題，還可提高馬鈴薯的附加值，減少食物資源的浪費。

回收馬鈴薯淀粉生產廢水中蛋白質的方法有泡沫分離法、膜分離法、加熱絮凝法、絮凝劑法以及綜合處理法等[10-13]。但利用海藻酸鈉作為絮凝劑回收馬鈴薯淀粉生產廢水中蛋白質的研究少見報道。海藻酸鈉是一種天然高分子化合物類型的絮凝劑，其來源廣泛，價格低廉，無毒無害，可供食用[14-16]。本研究以海藻酸鈉作為絮凝劑回收廢水中蛋白質，采用Box-Behnken試驗設計與響應面分析方法優化海藻酸鈉回收馬鈴薯蛋白質的工藝參數，為馬鈴薯淀粉廢水的處理及其蛋白的回收利用提供科學依據與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮馬鈴薯 市售。

海藻酸鈉(食品級) 青島明月海藻集團有限公司；牛血清蛋白(分析純)、三羥基甲基氨基甲烷(分析純)、甘氨酸(分析純) 上海惠世生化試劑有限公司；考馬斯亮藍R-250(分析純) 北京鼎國生物技術有限責任公司；硫酸、硫酸銅、三羥基甲基氨基甲烷、過硫酸銨、β-巰基乙醇等均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

MJ-60BE01B型組織搗碎機 美的生活電器有限公司；GB1302電子精密天平、SPN402F電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；CT15RT型高速冷凍離心機上海天美科學儀器有限公司；IT-09A-5恒溫磁力攪拌器上海一恒科技有限公司；PHS-3BW型電腦數顯酸度計上海理達儀器廠；TV-1901紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；L-8800全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 模擬馬鈴薯淀粉生產廢水的制備

將馬鈴薯洗凈，切塊，按馬鈴薯與水2∶1(質量比)的比例加水，同時加入NaHSO3(0.1g/kg)，在組織搗碎機中搗碎成漿，靜置15min后，用濾袋過濾，除去馬鈴薯渣，濾液在4000r/min轉速離心10min，上清液即為模擬馬鈴薯生產淀粉廢水[17]。

1.3.2 海藻酸鈉回收馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質

準確量取100mL馬鈴薯淀粉廢水于250mL的燒杯中，加入海藻酸鈉并調節pH值，用磁力攪拌器以300r/min的速度攪拌一定時間后，在4500r/min轉速離心15min，離心沉淀所得即回收的馬鈴薯蛋白質。

1.3.3 蛋白質含量的測定

廢水中蛋白質含量的測定：采用雙縮脲法[18]測定；回收馬鈴薯蛋白質含量的測定：采用GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》方法測定。

1.3.4 馬鈴薯蛋白質回收率計算

式中：m1為馬鈴薯淀粉生產廢水中蛋白質質量/g；m2為回收馬鈴薯蛋白質后廢水中蛋白質質量/g。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 海藻酸鈉添加量對馬鈴薯蛋白質回收率的影響

以馬鈴薯蛋白質回收率作為考核指標，在絮凝溫度35℃、攪拌時間30min、pH3.5的條件下，研究海藻酸鈉添加量0.3、0.5、0.7、0.9、1.1g/L對馬鈴薯蛋白質回收率的影響。

1.3.5.2 絮凝溫度對馬鈴薯蛋白質回收率的影響

以馬鈴薯蛋白質回收率作為考核指標，在海藻酸鈉添加量0.9g/L、攪拌時間30min、pH3.5的條件下，研究絮凝溫度25、30、35、40、45、50℃對馬鈴薯蛋白質回收率的影響。

1.3.5.3 攪拌時間對馬鈴薯蛋白質回收率的影響

以馬鈴薯蛋白質回收率作為考核指標，在海藻酸鈉添加量0.9g/L、絮凝溫度35℃、pH3.5的條件下，研究攪拌時間10、20、30、40、50min對馬鈴薯蛋白質回收率的影響。

1.3.5.4 pH值對馬鈴薯蛋白質回收率的影響

以馬鈴薯蛋白質回收率作為考核指標，在海藻酸鈉添加量0.9g/L、絮凝溫度35℃、攪拌時間30min的條件下，研究pH2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0對馬鈴薯蛋白質回收率的影響。

1.3.6 響應面優化試驗

在單因素的基礎上，以海藻酸鈉添加量、絮凝溫度、攪拌時間、pH值為試驗因素，以馬鈴薯蛋白質回收率為響應值，進行響應面優化試驗。采用Design Expert 8.0.6統計軟件，進行Box-Behnken設計及響應面分析試驗。試驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平表Table1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.7 SDS-PAGE測定回收馬鈴薯蛋白質的相對分子質量

采用SDS-PAGE法[18]對馬鈴薯蛋白質的相對分子質量進行測定，配制15%分離膠和5%濃縮膠，采用穩定電壓操作，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V。電泳結束后，采用考馬斯亮藍R-250對其染色。以標準蛋白質分子質量的對數繪制相對遷移率的標準曲線，并計算出回收馬鈴薯蛋白質的相對分子質量。

1.3.8 回收馬鈴薯蛋白質的氨基酸組分分析

16種氨基酸測定：按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》方法測定；色氨酸含量測定：按照GB/T 7650—1987《谷物不溶性膳食纖維測定》方法測定。

4.5 嚴格無菌操作 神經移位手術無菌技術的要求比一般手術更為嚴格。因為一般組織比神經組織對感染的防御能力強［3］。一旦手術感染，將對患者帶來嚴重后果。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 海藻酸鈉添加量對馬鈴薯蛋白質回收率的影響

圖1 海藻酸鈉添加量對馬鈴薯蛋白質回收率的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the recovery rate of protein

由圖1可知，隨著海藻酸鈉添加量的增加，馬鈴薯蛋白質回收率逐漸增大，當海藻酸鈉添加量為0.9g/L時，其回收率達到最大值，當海藻酸鈉添加量繼續增加時，其回收率有所下降。絮凝效果一般隨絮凝劑的添加量增加而增強，海藻酸鈉與蛋白質產生相互作用，使蛋白質沉淀下來，提高了蛋白質的回收率，但絮凝劑添加過量時，會使已經形成的絮體重新變成穩定的膠體[16]，影響絮凝效果。因此，海藻酸鈉添加量以0.9g/L為宜。

2.1.2 絮凝溫度對馬鈴薯蛋白質回收率的影響

圖2 絮凝溫度對馬鈴薯蛋白質回收率的影響Fig.2 Effect of flocculation temperature on the recovery rate of protein

由圖2可知，隨著絮凝溫度的升高，馬鈴薯蛋白質回收率達到最高值后開始下降。溫度為35℃時，其回收率達到最大值。絮凝溫度過低或過高都會影響回收效果，當絮凝溫度過低時，絮凝體的黏度下降，破壞海藻酸鈉已經形成的膠團，增加了水體對絮凝體的剪切作用，使絮凝體變得細小，不容易分離。絮凝的溫度過高時，雖然可以加快化學反應速度，但也會形成細小的絮凝體，影響分離效果。因此，絮凝溫度以35℃為宜。

2.1.3 攪拌時間對馬鈴薯蛋白質回收率的影響

圖3 攪拌時間對馬鈴薯蛋白質回收率的影響Fig.3 Effect of stirring time on the recovery rate of protein

2.1.4 pH值對馬鈴薯蛋白質回收率的影響

圖4 pH值對馬鈴薯蛋白質回收率的影響Fig.4 Effect of pH on the recovery rate of protein

由圖4可知，pH值對馬鈴薯蛋白質回收率有較為顯著的影響。隨著pH值的增大，廢水的黏度不斷增大[19]，廢水中蛋白質所帶電荷的性質和數量發生改變，使海藻酸鈉與蛋白質之間發生相互作用[20]，馬鈴薯蛋白質回收率迅速增大。但pH值繼續增大時，其回收率反而下降。當pH值為3.5時，絮凝效果較好，絮凝作用完全。選擇合適的pH值，不但影響絮凝效果，而且可節省大量的絮凝劑，從而降低了成本。因此，以pH3.5為宜。

2.2 響應面分析

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗

Box-Behnken試驗設計方案及結果見表2，利用Design Expert 8.0.6軟件對表2試驗數據進行二次多元回歸擬合，得到馬鈴薯蛋白質回收率(Y)對海藻酸鈉添加量(A)、絮凝溫度(B)、絮凝時間(C)、pH值(D)4個因素的二次多項式回歸模型為：

Y=69.00＋5.49A-1.86B＋5.06C＋2.40D＋1.52AB-3.11AC-1.09AD＋1.80BC＋1.13BD＋1.56CD-5.35A2-7.19B2-4.76C2-5.60D2

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table2 Box-Behnken design and results

表3 響應面試驗方差分析Table3 Analysis of variance for the fitted response surface model

由表3可以看出，模型P=0.0001＜0.01，表明回歸模型達到顯著水平，失擬項P=0.0863＞0.05，表明模型失擬項不顯著。模型的R2=98.89%，表明該模型與實際擬合較好，可以用此模型來分析和預測海藻酸鈉絮凝馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質工藝參數。方差分析結果顯示，A、B、C、D、AC、BC、A2、B2、C2、D2達到極顯著水平，AB、CD達到顯著水平，各因素對馬鈴薯蛋白質回收率的影響次序為：海藻酸鈉添加量＞攪拌時間＞pH值＞絮凝溫度。

2.2.2 各因素的交互作用對馬鈴薯蛋白質回收率的影響

根據回歸方程繪出響應面及等高線圖，如圖5所示。可以直觀的看出各因素及其交互作用對馬鈴薯蛋白質回收率的影響。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱。橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。

圖5 兩因素交互作用的響應曲面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interaction effects of process parameters on the recovery rate of protein

通過Design Expert軟件分析得到，利用海藻酸鈉作為絮凝劑回收馬鈴薯蛋白質的最佳工藝參數為海藻酸鈉添加量0.97g/L、絮凝溫度34.91℃、攪拌時間34.52min、pH3.62，此時馬鈴薯蛋白質回收率為71.42%。考慮到實際生產及可操作性，將最優工藝參數定為：海藻酸鈉添加量0.97g/L、絮凝溫度35℃、攪拌時間35min、pH3.6。

2.2.3 驗證實驗

為了驗證預測結果，按優化工藝參數進行重復實驗，重復3次，測定結果取平均值，得到馬鈴薯蛋白質回收率為70.93%，與預測值基本相符，表明響應面法得到的絮凝工藝參數準確可靠，具有實用價值。與鹽溶酸沉法[3]、酸熱法[21]、堿提酸沉法[17]等方法相比，本研究方法回收馬鈴薯蛋白質收率較為理想。

2.2.4 回收馬鈴薯蛋白質的相對分子質量測定結果

由圖6標準蛋白質的遷移距離，計算標準蛋白質的相對遷移率Rf，繪制標準蛋白質相對遷移率Rf與其分子質量對數lg(Mw)的關系，即標準蛋白分子質量的標準曲線，得到回歸方程為：y=-1.6867x＋2.143，R2=0.9817。由圖6可以看出，1泳道中出現6條主帶，計算出馬鈴薯蛋白質分子質量分別為42.66、38.43、23.08、22.02、18.55、16.48kD。除6條主帶外，還有分子質量在76.91、66.01、57.99、9.94kD的淺帶。

圖6 馬鈴薯蛋白質SDS-PAGE電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE of the recovered protein

2.2.5 回收馬鈴薯蛋白質氨基酸組成

圖7 馬鈴薯蛋白質16種氨基酸圖譜Fig.7 Chromatogram of sixteen amino acids in the recovered protein

圖8 色氨酸標準圖譜及馬鈴薯蛋白質圖譜Fig.8 Chromatograms of tryptophan standard and the recovered protein

由圖7、8和表4可知，采用海藻酸鈉回收馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質的含量為72.08%。馬鈴薯蛋白質中分離出17種氨基酸，其必需氨基酸含量為28.00%，非必需氨基酸含量為41.43%，其中，必需氨基酸中色氨酸含量較低，色氨酸為馬鈴薯蛋白粉的第一限制性氨基酸。馬鈴薯蛋白質必需氨基酸含量占總氨基酸含量的40.33%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值為0.68，其分別高于WHO/FAO標準規定的40%和0.6，大豆蛋白38.5%和0.56[21]，除此之外，馬鈴薯蛋白質還含有較高的賴氨酸，賴氨酸是谷物蛋白質第一限制性氨基酸，馬鈴薯蛋白可彌補谷物蛋白的缺陷。

表4 馬鈴薯蛋白質氨基酸組分Table4 Amino acid composition of the recovered protein

3 結 論

采用Box-Behnken設計，建立海藻酸鈉回收馬鈴薯蛋白質工藝參數的二次多項式數學模型，經檢驗該模型是合理的，能夠較好的預測馬鈴薯蛋白質的回收率。在利用海藻酸鈉回收馬鈴薯蛋白質的過程中，各因素對馬鈴薯蛋白質回收率影響主次順序依次為海藻酸鈉添加量＞攪拌時間＞pH值＞絮凝溫度，所得最佳工藝參數為海藻酸鈉添加量0.97g/L、絮凝溫度35℃、攪拌時間35min、pH3.6，馬鈴薯蛋白質回收率為70.93%。利用氨基酸自動分析儀測定海藻酸鈉回收馬鈴薯蛋白質的氨基酸組分，實驗證明，回收的馬鈴薯蛋白質總氨基酸含量為69.43%，必需氨基酸含量為28.00%，占總氨基酸含量的40.33%，優于大豆蛋白，其第一限制性氨基酸為色氨酸，此外，馬鈴薯蛋白質賴氨酸含量較高，可以彌補谷物蛋白賴氨酸缺乏。

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Application of Response Surface Methodology to Optimize Extraction of Protein from Potato Starch Wastewater by Sodium Alginate

LIU Ting-ting，YAO Jia，ZHANG Fei-jun，WANG Da-wei*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Sodium alginate was used as a natural polymer flocculant to recover protein from potato starch wastewater. In addition, the amino acid composition of the recovered protein was analyzed. Box-Behnken design coupled with response surface analysis was used to optimize four variables for recovering protein including sodium alginate dosage, pH, temperature and stirring time. The optimal process conditions of the variables were found to be stirring with 0.97 g/L sodium alginate at pH 3.6 for 35 min at 35 ℃, resulting in a protein recovery of 70.93%. The total amino acid content of the recovered protein was 69.43% and the ratio of essential amino acids to total amino acids was 40.33%. Tryptophane was the first limiting amino acid.

sodium alginate；potato starch；wastewater；protein

X703

A

1002-6630(2013)18-0075-07

10.7506/spkx1002-6630-201318016

2013-04-01

長春市科技發展計劃項目(長科技合2011191)；吉林省科技成果轉化補助項目(20115016)

劉婷婷(1984—)，女，講師，博士，研究方向為糧食、油脂與植物蛋白工程。E-mail：ltt1984@163.com

*通信作者：王大為(1960—)，男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂與植物蛋白工程及功能食品。E-mail：xcpyfzx@163.com