基于混合床離子交換樹脂脫鹽的草魚肽及其理化性質

崔 誠，陳 悅，陳季旺,*，夏文水,2

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

基于混合床離子交換樹脂脫鹽的草魚肽及其理化性質

崔 誠1，陳 悅1，陳季旺1,*，夏文水1,2

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

研究混合床離子交換樹脂對草魚肽的脫鹽工藝條件，并分析脫鹽后草魚肽的理化性質。結果表明：脫鹽的較佳工藝條件為上樣質量濃度10mg/mL、流速6BV/h、pH7.0、陰陽離子樹脂混合比例為2:3。在該工藝條件下，脫鹽率達到81.7%，肽回收率為80.5%，草魚肽灰分從17.5%降低到3.2%，肽含量從80.9%增加到90.3%。脫鹽后草魚肽的相對分子質量分布范圍主要集中在190～1000之間，含量達到了91.5%；溶解度在pH2～10范圍內均大于95%，溶液質量濃度達到40g/100mL時，其黏度只有4.5mPa·s，具有高質量濃度、低黏度的特點。

草魚肽；混合床離子交換樹脂；理化性質

魚源寡肽是利用蛋白酶特異性水解魚類蛋白質產生的一類相對分子質量在200～10000之間的肽類物質。魚源寡肽不僅具有魚源蛋白質的優點，同時還具有良好的溶解性、熱穩定性等理化性質以及易消化吸收等生理功能。目前，研究酶水解法制備寡肽成為魚類加工中的一個前沿課題[1-3]。草魚是7種大宗淡水魚類之一，食性簡單，餌料來源廣泛，肉質肥嫩，味鮮美，且生長迅速，產量高。2010年，我國7種大宗淡水魚的總產量為1623.4萬t，草魚產量占淡水魚總產量的18%。因此，草魚是一種良好的制備魚源寡肽的原料來源[4]。

在酶解魚源蛋白質生產寡肽的過程中，需不斷地加入堿液中和酶解蛋白質產生的H+維持反應體系的pH值恒定，魚源寡肽的鹽分含量較高，主要為NaCl。這些鹽分的存在影響了魚源寡肽的風味、理化性質和生物活性，需要進行脫鹽處理[5-6]。目前生物活性物質的脫鹽方法主要有透析、超濾和納濾等，但是這些方法對小分子物質脫鹽效果不佳或無法實現[7-10]。盡管大孔吸附樹脂用于小分子物質的脫鹽具有選擇性好、再生處理方便、吸附迅速以及解吸容易、對脫鹽原料理化性質影響小等特點，但是由于其只吸附疏水性高的小分子物質，回收率不高，且我國對大孔吸附樹脂在保健食品及其原料生產過程有嚴格的限制[11-14]。

離子交換樹脂由于交換容量高、交換速度快、吸附容量大、選擇性好、易于解吸附、化學性能穩定、不溶于酸、堿及任何有機溶劑等，常用于去除水中各種陰陽離子和氨基酸的分離[15-17]。傳統的離子交換樹脂脫鹽采用分別通過陰陽離子交換樹脂，脫鹽過程繁瑣，并且由于離子交換過程中會使體系的pH值不穩定，導致許多寡肽分子在溶液中帶有電荷，造成了寡肽的損失[17]。混合床離子交換樹脂脫鹽過程中，體系pH值比較穩定以及陰陽離子的相互作用都會大大減少寡肽的損失[18]。

本實驗通過研究混合床離子交換樹脂對酶解制備草魚肽的脫鹽效果，確定其較佳脫鹽工藝條件，并分析脫鹽后草魚肽的理化性質，為草魚肽的工業化生產以及后續結構與生化性質關系分析提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮草魚 武漢市購。

001×16(Na)型陽離子交換樹脂、D301-G(Cl)型陰離子交換樹脂 江蘇蘇青水處理工程集團有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Delta320精密pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DDS-11C電導率儀 上海雷磁儀器廠；LD5-10型離心機 北京醫用離心機廠；LG-3型冷凍干燥機 寧波市生化儀器廠；HL-2S恒流泵 上海滬西分析儀器廠；UV-2100紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；TGL-16C高速離心機 上海安亭儀器有限公司；NDJ-79型旋轉黏度計 上海昌吉地質儀器有限公司；超濾裝置(聚砜中空纖維超濾膜，膜面積為0.1m2，尺寸為Ф40mm×300mm，截留相對分子質量10000) 上海亞東核級樹脂有限公司；600高效液相色譜儀(配2487紫外檢測器和Empower工作站) 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 原料成分分析

蛋白質含量的測定：采用微量凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》)，轉換系數F=6.25；水分的測定：采用105℃恒質量法(GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測定》)；灰分的測定：采用550～600℃灰化法(GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的測定》)；肽含量測定：參考GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》。

1.3.2 草魚肽的制備

草魚肉經絞碎勻漿，配成30g/100mL的溶液，調pH9.0，在50℃條件下，按48AU/kg的酶與底物比加入一定量的堿性蛋白酶酶解2h，然后調pH7.0，按2:1的比例添加一定量的中性蛋白酶酶解30min，酶解完成后調pH5.5滅酶15min，3000r/min離心20min，收集上清液調節pH7.0進行超濾，真空濃縮，冷凍干燥得到草魚肽。

1.3.3 超濾預處理

在室溫條件下，操作壓力為0.1MPa，將50mg/mL的草魚肽溶液注入儲槽中，在泵的推動力下，溶液經微濾后進入超濾膜中。從中空纖維膜的內壁滲透出來的小分子寡肽是超濾液，溶液中的大分子多肽等被截留濃縮，返回到儲槽中；如此反復循環，收集超濾液[19]。

1.3.4 混合床離子交換樹脂脫鹽

1.3.4.1 不同流速對草魚肽脫鹽效果的影響

在室溫條件下，將10mg/mL的草魚肽溶液pH值調為7.0，分別以1、2、4、6、8BV/h的流速通過陰、陽離子按3:2的比例組成的混合床進行脫鹽，收集流出液，測定電導率和肽含量，按式(1)、(2)計算電導率變化率和肽回收率，確定較佳的流速。

1.3.4.2 pH值對脫鹽效果的影響

在室溫條件下，將10mg/mL的草魚肽溶液pH值分別調為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以較佳的流速通過陰、陽離子按3:2的比例組成的混合床進行脫鹽，收集流出液，測定電導率和肽含量，并計算肽回收率和電導率變化率，確定較佳的pH值。

1.3.4.3 陰陽離子交換樹脂比例對脫鹽效果的影響

在室溫條件下，將10mg/mL的肽溶液調為較佳的pH值，以較佳的流速通過陰、陽離子按1:2、2:3、1:1、3:2、2:1比例組成的混合床進行脫鹽，收集流出液，測定電導率和肽含量，并計算肽回收率和電導率變化率，確定較佳的樹脂比例。

1.3.5 溶解性的測定

將2g草魚肽加入100mL水中，用1.0mol/L鹽酸和1.0mol/L氫氧化鈉溶液調節pH2～10，室溫條件下1000r/min攪拌1h，3000r/min離心20min，測上清液中肽含量[19]，溶解度按公式(3)計算。

1.3.6 黏度的測定

在室溫條件下，將草魚肽配制成5、10、20、30g/100mL和40g/100mL，pH7.0的溶液，測定溶液的表觀黏度。對比草魚蛋白和草魚肽的黏度，分析黏度的變化[19]。

1.3.7 相對分子質量分布測定

高效液相色譜儀：Waters 600/2487；色譜柱：TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm；流動相：乙腈-水-三氟乙酸(45:55:0.1，V/V)；檢測波長：220nm；柱溫：30℃；流速：0.5mL/min。相對分子質量標準品：細胞色素C(Mr12500)、抑肽酶(Mr6500)、桿菌酶(Mr1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mr451)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mr189)[20]。

2 結果與分析

2.1 混合床離子交換樹脂脫鹽

2.1.1 不同流速對草魚肽脫鹽效果的影響

圖1 不同流速條件下草魚肽的肽回收率和電導率變化率Fig.1 Effect of sample loading flow rate on peptide recovery and conductivity

從圖1可以看出，隨著流速的增加，脫鹽后的草魚肽溶液電導率變化率不斷減小，肽回收率不斷增加。當流速從1BV/h增加到8BV/h時，脫鹽后草魚肽溶液的電導率從107.3μS/cm增加到292μS/cm，電導率變化率從96.6%降低到88.9%，肽回收率從58.6%增加到78.2%。這可能是由于流速過快時，草魚肽溶液與樹脂接觸時間很短，脫鹽率降低；流速較慢時，草魚肽溶液與樹脂接觸時間很長，樹脂對溶液中的草魚肽分子吸附程度增加，造成了肽的損失較大，肽回收率較低[18]。綜合考慮，選擇流速為6BV/h，此時的電導率變化率為93.2%，肽回收率為77.2%。

2.1.2 pH值對草魚肽脫鹽效果的影響

圖2 不同pH值條件下草魚肽的肽回收率和電導率變化率Fig.2 Effect of pH on peptide recovery and conductivity

從圖2可以看出，pH值對肽回收率影響較大，對電導率變化率的影響不明顯。pH5～7范圍內，脫鹽后的草魚肽溶液電導率從170.6μS/cm增加到173.3μS/cm，電導率變化率從94.6%降低到93.7%，肽回收率從72.2%增加到77.2%；pH7～9范圍內，脫鹽后的草魚肽溶液電導率從173.3μS/cm增加到347.0μS/cm，電導率變化率從93.7%降低到89.8%，肽回收率從77.2%降低到67.7%。這可能是由于溶液的pH值會影響到體系的離子化程度，當pH值偏小或偏大時，溶液的離子化程度較大，樹脂對溶液中的草魚肽分子吸附程度增加，肽損失較多[18]。綜合考慮，選擇pH7.0為較佳的pH值，此時的電導率變化率為93.7%，肽回收率為77.2%。

2.1.3 陰、陽離子交換樹脂比例對草魚肽脫鹽效果的影響

圖3 不同樹脂比例條件下草魚肽的肽回收率和電導率變化率Fig.3 Effect of anion/cation exchange resin ratio on peptide recovery and conductivity

陰、陽離子樹脂混合比例對草魚肽脫鹽效果的影響見圖3。可以看出，陰、陽離子樹脂混合比例在1:2～2:3范圍，脫鹽后草魚肽溶液電導率從529.0μS/cm降低到191.1μS/cm，電導率變化率從78.3%增加到91.8%，肽回收率從86.7%降低到79.7%；陰、陽離子樹脂混合比例在2:3～2:1范圍，脫鹽后草魚肽溶液電導率變化率基本不變，肽回收率從79.7%降低到75.2%。這可能是由于大孔型離子交換樹脂有較多的物理孔隙，吸附能力強，而凝膠型離子交換樹脂吸附能力相對較弱。實驗中的D301-G型陰離子樹脂是大孔型離子交換樹脂，001×16型陽離子樹脂是凝膠型離子交換樹脂，隨著混合床中陰離子樹脂所占比例的增加，體系對草魚肽的吸附能力也不斷增加，造成了肽的損失，同時陰、陽離子比例混合不當也會使脫鹽過程中體系pH值發生比較明顯的變化，從而造成寡肽的損失[18]。綜合考慮，選擇陰、陽離子樹脂混合比例為2:3。

2.1.4 混合床陰陽離子交換樹脂脫鹽前后草魚肽的成分

綜合單因素試驗結果，確定草魚肽脫鹽的較佳工藝條件為上樣質量濃度10mg/mL、流速6BV/h、pH7.0、陰、陽離子樹脂混合比例為2:3。在該工藝條件下對草魚肽進行脫鹽，收集的脫鹽液經真空濃縮和冷凍干燥后得到草魚肽，脫鹽率為81.7%，肽回收率為80.5%，其成分分析結果見表1。脫鹽后的草魚肽肽含量明顯增加，從80.9%增加到90.3%，灰分含量明顯降低，從17.5%降低到3.2%，脫鹽效果良好。

表1 草魚肽脫鹽前后的成分Table1 The components of grass carp peptides between desalination and undesalination

2.2 草魚肽和草魚蛋白的溶解性

圖4 草魚蛋白和草魚肽在不同pH值時的溶解性Fig.4 Comparison of the effect of different desalination techniques on components of GCPs

對草魚蛋白和草魚肽在pH2～10范圍內的溶解度進行了測定，結果見圖4。在pH2～10范圍，脫鹽后草魚肽的溶解度明顯高于草魚蛋白。當在pH2～4范圍，草魚蛋白的溶解度由61.5%下降到17.7%；pH4～10范圍，其溶解度由17.7%增加到60.8%。草魚肽在pH2～10范圍內，溶解度基本上沒變化，并且均大于95%。可能是草魚蛋白酶解后，極性基團(—COOH和—NH2)增加，分子表面電荷增多，加強了分子與水溶液之間的靜電作用。由于草魚肽具有良好的溶解性，且不受pH值的影響，因此適用于酸性和高蛋白飲品。

2.3 草魚肽和草魚蛋白溶液的黏度

圖5 不同質量濃度草魚肽和草魚蛋白的黏度Fig.5 Effect of peptide concentration on the viscosity of GCPs

不同質量濃度草魚肽和草魚蛋白的黏度變化見圖5。在不同質量濃度范圍內，脫鹽后草魚肽的黏度明顯低于草魚蛋白。可能是草魚蛋白經酶解后，分子質量和分子體積減小，使得分子的有序性增加，導致黏度下降。草魚肽的黏度隨著質量濃度的增加而逐漸增大，在5～20g/100mL的低質量濃度范圍，黏度很小且變化緩慢，從1.1mPa·s增加到1.8mPa·s。在20～40g/100mL的高質量濃度范圍，黏度變化較快，從1.8mPa·s增加到4.5mPa·s。草魚肽溶液質量濃度達到40g/100mL，其黏度只有4.5mPa·s，說明草魚肽具有高質量濃度、低黏度的特點，適用于高蛋白流體食品。

2.4 草魚肽和草魚蛋白的相對分子質量分布

圖6 草魚蛋白、脫鹽前后草魚肽的相對分子質量分布Fig.6 HPLC patterns of grass carp protein, GCPs and desalinated GCPs

表2 草魚蛋白、脫鹽前后草魚肽的相對分子質量分布Table2 Relative molecular mass distribution of grass carp protein, GCPs and desalinated GCPs

草魚蛋白、脫鹽前草魚肽和脫鹽后草魚肽的相對分子質量分布結果見圖6和表2。草魚蛋白相對分子質量分布范圍較廣，相對分子質量大于1500的肽組分含量高達77.4%；酶解制備的草魚肽相對分子質量明顯降低且分布范圍較窄，主要集中在190～1000之間；脫鹽前后的草魚肽相對分子質量分布基本沒有變化，只是相對分子質量1000以上組分的含量從6.5%降低到4.5%，說明在精制脫鹽過程中，損失了一定量的大分子多肽，小分子寡肽含量基本沒有損失。脫鹽后草魚肽相對分子質量在1000以上和190以下組分的含量較低，分別為4.5%和4.0%；其次為相對分子質量在500～1000之間的組分，含量為32.3%；相對分子質量在190～500之間的組分含量最高，為59.2%。說明草魚肽主要是由一些相對分子質量較低的寡肽組成。

3 結 論

3.1 混合床離子交換樹脂對草魚肽脫鹽的較佳工藝條件為：上樣質量濃度10mg/mL、流速6BV/h、pH7.0、陰陽離子樹脂混合比例為2:3。在該工藝條件下脫鹽率達到81.7%，肽回收率為80.5%。脫鹽后的肽含量從超濾后的80.9%增加到90.3%，灰分從17.5%降低到3.2%，說明混合床離子交換樹脂能較好的脫去草魚肽中的鹽，且小分子寡肽損失較少，可用于草魚肽的工業化脫鹽精制。

3.2 脫鹽后草魚肽的相對分子質量分布范圍主要集中在190～1000之間，含量達到了91.5%；草魚肽的溶解度在pH2～10范圍內均大于95%以上，適用于酸性和高蛋白飲品；草魚肽具有高質量濃度、低黏度的特點，適用于高蛋白流體食品。

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Desalination Using Mixed-Bed Ion Exchange Resin and Physiochemical Properties of Grass Carp Peptides

CUI Chen1，CHEN Yue1，CHEN Ji-wang1,*，XIA Wen-shui1,2
(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan Unviersity, Wuxi 214122, China)

In the present study, we investigated the process conditions for desalinating grass carp peptides (GCPs) using mixed-bed ion exchange resin and characterized desalinated GCPs. The optimal desalination conditions for GCPs were sample concentration of 10 mg/mL, loading flow rate of 6 BV/h, pH 7.0 and anion/cation exchange resin ratio of 2:3. Under these conditions, the desalination rate was 81.7% and the peptide recovery was 80.5%; meanwhile, the ash content in GCPs was reduced from 17.5% to 3.2%, and the peptide content was increased from 80.9% to 90.3%. The relative molecular mass of desalinated GCPs was mostly distributed in the range of 190 to 1000 in an amount of 91.5%, solubility was greater than 95% in the pH range of 2 to 10, and viscosity was only 4.5 mPa?s at the concentration of 40 g/100 mL.

grass carp peptides；mixed-bed ion exchange resin；physiochemical properties

TS254.9

A

1002-6630(2013)18-0023-05

10.7506/spkx1002-6630-201318005

2012-08-21

國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-46)；國家“863”計劃項目(2010AA023003)；武漢工業學院研究生創新基金項目(2010CX014)

崔誠(1988—)，男，碩士，研究方向為水產品加工及貯藏工程。E-mail：Cuicheng.2008@163.com

*通信作者：陳季旺(1970—)，男，教授，博士，研究方向為水產品加工及貯藏工程。E-mail：jiwangchen1970@126.com