響應面法優化桑黃發酵液總多糖的提取工藝

梁大勇，趙 晨，黃 芳，宋愛榮*

(青島農業大學 山東省應用真菌重點實驗室，山東 青島 266109)

響應面法優化桑黃發酵液總多糖的提取工藝

梁大勇，趙 晨，黃 芳，宋愛榮*

(青島農業大學 山東省應用真菌重點實驗室，山東 青島 266109)

為確定桑黃發酵液多糖提取的最佳工藝條件，以桑黃多糖的含量為考察指標，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對主要提取工藝參數進行優化，并得到回歸模型。結果表明：桑黃發酵液多糖提取的最優工藝條件參數為提取pH12、提取溫度96℃、提取時間1.6h。在此條件下，桑黃多糖含量達到11.67mg/mL。實驗證明模型擬合程度良好，誤差較小。

桑黃；液體發酵；多糖；提取；響應面法

桑黃Phellinus igniarius(L.:Fr.)Quél.是一種頗具藥用價值的多年生大型真菌，因多生長于桑屬植物上，且子實體多為黃褐色而得名，又名火木層孔菌、桑臣、桑耳[1-2]，桑黃成分復雜，含有多糖、黃酮、三萜、甾醇、香豆素類化合物等多種活性成分[3-5]。在我國民間桑黃用于治療血崩、血淋、脫肛瀉血、臍腹澀痛、閉經、脾虛泄瀉等[6]。現代藥理學研究證明，桑黃多糖具有抗腫瘤、抑制肝纖維化、提高免疫力、降低血糖、抗病毒等功效[7-9]，且抗腫瘤活性優于多種真菌類藥物[10]。

桑黃在自然界中形成子實體稀少，而且形成可用子實體需要多年，而人工栽培難度較大、周期較長，這就造成此菌的價格較高，難以滿足市場需要。因此，通過野生環境獲得桑黃子實體已不能滿足需要，桑黃液體發酵培養獲得大量活性物質技術開始應運而生，使得桑黃多糖成為穩定的工業產品來源[11]。本研究采用液體深層發酵的方法，獲得桑黃發酵液，并通過Box-Behnken響應曲面分析法設計多糖提取實驗[12-13]，獲得數據，有效地建立多糖含量和連續參數變量之間的定量關系，從而快速確定最佳生產條件，為大規模生產桑黃發酵液多糖提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃(Phellinus igniarius)菌種由山東省應用真菌重點實驗室提供。

平板菌種培養基：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH6.8，瓊脂2%；液體菌種培養基：葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，酵母膏0.5%，pH6.8；液體深層發酵培養基：葡萄糖3%，酵母膏0.3%，馬鈴薯淀粉1%，KH2PO40.01%，MgSO40.05%，pH6.8。

1.2 儀器與設備

HZ.B-81回轉式恒溫調速搖床 普誠科技有限公司；PHS-3精密pH計 上海雷磁儀器廠；TGL-16G高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；BIOTECH-X BS型20L小型發酵罐、KQ-C型全自控蒸汽發生器 上海保興生物公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵液制備

采用小型發酵罐培養桑黃菌絲體，培養基14L，培養溫度28℃，接種量10%，轉速200r/min，通氣量14L/min，培養7d。

1.3.2 多糖測定

發酵液總糖和還原糖的測定：總糖測定采用蒽酮-硫酸法[14]，以葡萄糖為對照品作標準曲線，多糖質量濃度在0～0.024mg/mL吸光度和總糖質量濃度呈良好的線性關系，標準曲線方程為A=19.304C總糖(n=6)，R2=0.9990。式中：A為吸光度；C總糖為總糖的質量濃度/(mg/mL)。

還原糖測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[15]，以葡萄糖為對照品作標準曲線，在0～0.6mg/mL質量濃度范圍內，還原糖和吸光度呈良好的線性關系，繪制標準曲線圖，標準曲線方程為A=1.3002C還原糖(n=6)，R2=0.9990。式中：A為吸光度；C還原糖為還原糖的質量濃度/(mg/mL)。

粗多糖的含量/(mg/mL)=總糖的含量-還原糖的含量1.3.3 多糖提取基本條件[16]

500mL發酵全液經剪切乳化機打碎后，用1mol/L NaOH溶液調節發酵全液pH值至12，100℃沸水浸提1h，5000×g離心10min，取上清液測定多糖含量。

1.3.4 單因素試驗

在提取時間0.5、1、1.5、2、2.5、3h，提取溫度80、85、90、95、100℃，提取pH值為8、9、10、11和12條件下，按照1.3.3節方法探討提取pH值、提取溫度和提取時間對桑黃發酵液多糖含量的影響。

1.3.5 響應曲面優化試驗設計[17]

表1 響應面試驗因素水平表Table1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken試驗設計，選取提取時間、提取溫度、提取pH值 3個影響因子(自變量)，采用3因素3水平的響應曲面分析方法，分別用X1、X2、X3表示3個因素，并以＋1、0、-1分別代表變量的水平，按方程Xi=(xi-x0/Δx)對自變量進行編碼(表1)。其中，Xi為變量的編碼值，xi為變量的真實值，x0為試驗中心點變量的真實值，Δx為變量的變化步長，多糖含量Y/ (mg/mL)為響應值。采用多元回歸設計方法，擬合二次多項模型的Box-Behnken試驗設計見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對桑黃多糖含量的影響

500mL發酵全液經剪切乳化機打碎后，在提取溫度100℃、pH12的條件下，考察不同提取時間對多糖含量的影響，結果如圖1所示。

圖1 提取時間對多糖含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on polysaccharide content

由圖1可知，在0.5～1.5h時，隨著提取時間的延長，發酵液多糖含量呈上升趨勢。當提取時間為1.5h時，多糖含量最高；但當提取時間進一步延長時，發酵液多糖含量呈不斷下降趨勢，因此提取時間以1.5h為宜。

2.1.2 提取溫度對桑黃多糖含量的影響

500mL發酵全液經剪切乳化機打碎后，在提取時間1.5h、pH12的條件下，考察不同提取溫度對多糖含量的影響，結果如圖2所示。

圖2 提取溫度對多糖含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on polysaccharide content

由圖2可知，隨溫度的升高，發酵液多糖含量不斷增加，到達95℃時多糖含量達到最高；當提取溫度進一步增加時，多糖含量略有下降。提取過程中還發現，隨著溫度的升高，還原糖的含量呈上升趨勢，考慮到高溫可能對多糖的結構與活性有一定影響，溫度過高多糖易產生降解，而且溫度過高，增加能耗，所以選擇90～95℃作為提取的最佳溫度。

2.1.3 提取pH值對桑黃多糖含量的影響

500mL發酵全液經剪切乳化機打碎后，在提取時間1.5h、溫度95℃的條件下，考察不同提取pH值對多糖含量的影響，結果如圖3所示。

圖3 提取pH值對多糖含量的影響Fig.3 Effect of extraction pH on polysaccharide content

由圖3可知，在提取pH值為8～10時，隨著pH值的升高，多糖含量上升趨勢比較平緩；當pH值從10升到11時，多糖含量顯著地升高，趨勢較陡，這可能是由于強堿性條件加快細胞壁的破裂，細胞內多糖溶解到發酵液中所致；當pH值進一步升高時，多糖含量呈下降趨勢，因此選擇提取最佳pH值為11。

2.2 響應面法優化提取條件

2.2.1 試驗設計與結果

利用Design-Expert 8.0軟件設計響應面試驗，根據Box-Behnken設計原理，綜合單因素試驗結果，選擇提取時間、提取溫度和提取pH值3個因素所確定的水平范圍，以多糖含量為響應值，進行3因素3水平，共17個試驗點的響應面分析，試驗以隨機次序進行[18]，結果見表2。

圖3 提取pH值對多糖含量的影響Fig.3 Effect of extraction pH on polysaccharide content

2.2.2 回歸模型建立及方差分析

經Design-Expert 8.0軟件對表2試驗結果進行多元回歸擬合，建立二次多項式回歸模型。

表3 回歸方程各項方差分析Table3 Analysis of variance for each term of the fitted regression equation

由表3方差分析可知，該回歸模型顯著。各因素經二次多項回歸擬合后，得到二次多項回歸方程：Y=11.51＋0.38X1＋0.70X2＋0.95X3-0.29X1X2-0.32X1X3＋0.33X2X3-0.42X12-1.52X22-0.95X32。提取時間、提取溫度和提取pH值三個因素在試驗過程中均起主要作用，二次項X22、也是顯著的，但各種因素的交互作用的影響都不顯著，說明各因素之間的交互作用很小；失擬項P=1.13＞0.05，差異不顯著，表明建立的二次多項式回歸模型能運用于桑黃發酵液多糖提取優化的理論預測；R2=0.9557，說明模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型能夠反映響應值的變化。

圖4 兩因素及其交互作用響應面圖Fig.4 Response surface plots for the effects of extraction parameters on polysaccharide content

對表3的結果作響應面分析，見圖4，其中各圖表示X1、X2、X3中任意一個變量取零水平時，其余兩個變量對多糖提取率的交互影響。由圖4可知，提取pH值是影響桑黃發酵液多糖含量的最主要因素，提取溫度次之，選擇合適的提取pH值和提取溫度，可獲得較高的提取率。通過軟件分析，預測出桑黃發酵液多糖提取的最優工藝水平編碼值，即X1=0.16、X2=0.27、X3=0.52，相當于提取時間1.58h、提取溫度96.35℃、提取pH11.52，在此條件下預測多糖含量為11.88mg/mL。考慮到實際操作的方便性，將各因素修正為提取時間1.6h、提取溫度96℃、提取pH12，在修正條件下進行驗證實驗，得到桑黃發酵液多糖含量為11.67mg/mL，與預測值基本一致，驗證了方程的可行性。

3 結 論

在單因素試驗的基礎上，將Box-Behnken試驗設計的響應面法應用于優化藥用真菌桑黃活性多糖提取的研究，利用較少的實驗次數，獲得最佳優化條件。結果表明：提取時間、提取溫度和提取pH值對桑黃多糖含量影響顯著，對提取過程的影響不是簡單的線性關系，由此建立的回歸模型擬合程度良好，理論值和預測值基本一致，適合工業化大生產的應用。

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Optimization of Extraction Process for Polysaccharides from Phellinus igniarius Fermentation Broth by Response Surface Methodology

LIANG Da-yong，ZHAO Chen，HUANG Fang，SONG Ai-rong*
(Shandong Provincial Laboratory of Applied Mycology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

Response surface methodology was used to optimize main process parameters for the extraction of polysaccharides from Phellinus igniarius fermentation broth based on polysaccharide content of extracts. A regression model equation was fitted. The optimum extraction conditions were found to be pH 12, 96 ℃ and 1.6 h. The extract obtained under these conditions contained 11.67 mg/mL polysaccharides. The fitted regression model had excellent goodness of fit and showed lower prediction error.

Phellinus igniarius；liquid fermentation；polysaccharide；extract；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2013)04-0114-04

2012-02-06

山東省科技攻關項目(2010GNC10956)

梁大勇(1983—)，男，碩士，研究方向為藥用真菌活性物質分離純化及藥理活性。E-mail：dayongliang@126.com

*通信作者：宋愛榮(1952—)，女，研究員，本科，研究方向為食藥用菌資源與育種、應用真菌發酵與有效成分提取。E-mail：airongsong@163.com