雙層包埋制備嗜酸乳桿菌微膠囊及其應用

馬 嫄，段顯萍，劉 蕓，龔 麗

(西華大學生物工程學院，四川 成都 610039)

雙層包埋制備嗜酸乳桿菌微膠囊及其應用

馬 嫄，段顯萍，劉 蕓，龔 麗

(西華大學生物工程學院，四川 成都 610039)

為確保嗜酸乳桿菌抵抗機械擠壓、胃酸等不適條件，順利到達腸道發揮益生作用，以多孔淀粉為壁材微膠囊化嗜酸乳桿菌，通過單因素試驗和正交試驗考察pH值、振蕩時間、多孔淀粉用量、溫度4個因素對嗜酸乳桿菌微膠囊化的影響。結果表明：108CFU/mL嗜酸乳桿菌懸液50mL、多孔淀粉用量5g、pH6.0、溫度20℃、200r/min振蕩50min的最佳工藝條件下，制得微膠囊包埋嗜酸乳桿菌包埋率為67.12%；將其飼喂幼犬后，檢測犬糞便中雙歧桿菌、乳酸菌、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌、pH值的變化，結果表明嗜酸乳桿菌微膠囊可有效改善犬腸道微生態。

嗜酸乳桿菌；微膠囊；多孔淀粉；包埋

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus，LA)屬革蘭氏陽性無芽孢桿菌科的乳桿菌屬，是廣泛存在人體和一些動物腸道內的益生菌。嗜酸乳桿菌是兼性厭氧菌，最適生長溫度為35～38℃，最適pH值為5.5～6.0[1-3]。多孔淀粉(microprous starch)是指具有生淀粉酶活力的酶在低于淀粉糊化溫度下作用于生淀粉顆粒后形成的一種蜂窩狀多孔變性淀粉。其表面的淀粉孔可作為一個容器包埋嗜酸乳桿菌，減輕機械擠壓、胃酸等對嗜酸乳桿菌的影響，使其順利到達腸道發揮益生作用[4-7]。目前就嗜酸乳桿菌的益生效果保護技術主要有深冷凍技術和微膠囊技術，微膠囊技術多為單層包埋處理[7-15]。本實驗采用雙層包埋技術，以多孔淀粉為內壁材，包埋嗜酸乳桿菌，采用海藻酸鈉為外壁材，經復凝聚法，通過冷凍干燥制備高活菌率的益生菌微膠囊；并通過飼喂幼齡犬仔，檢測喂養一段時間后犬腸道內菌群的變化，評價嗜酸乳桿菌微膠囊對幼犬腸道菌群的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜酸乳桿菌由中國工業微生物菌種保藏管理中心提供。

多孔淀粉 遼寧立達生物科技有限公司；海藻酸鈉、氯化鈣(分析純) 成都科龍化工試劑公司。

1.2 儀器與設備

lyolab3000冷凍干燥機 丹麥Heto公司；SHA-B數顯恒溫振蕩器 金壇市富華儀器有限公司；SGSP-02電熱恒溫隔水式培養箱 黃石市恒豐醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與收集

將經活化并培養18h的菌液，在低溫高速離心機(4℃，1000r/min)離心一定時間，然后用少量生理鹽水沖洗沉淀，倒入滅過菌的三角燒瓶中，加好塞子在4℃冰箱中保存。根據GB 4789.2—2010《菌落總數測定》[16]的方法進行平板稀釋法計數。將配置好的MRS固體培養基經高溫滅菌后，在無菌操作條件下倒平板，冷卻。并取1mL菌液于生理鹽水中，適當稀釋數倍后，取5個濃度梯度(10-6～10-10)，每個梯度移取0.2mL菌液于經冷卻凝固好的培養基中，(37±1)℃恒溫箱培養24h后，菌落計數。再根據計數，將離心后的菌體用滅菌后的生理鹽水適當稀釋，調整活菌接種量至108CFU/mL，以備用。

1.3.2 嗜酸乳桿菌微膠囊的制備

在無菌操作條件下，稱取一定量的多孔淀粉于燒杯中，加入108CFU/mL菌懸液50mL，用NaOH、HCl溶液調pH值，再在適溫條件下振蕩吸附數十分鐘，至完全吸附，加入質量分數為2%的海藻酸鈉溶液，攪拌均勻后擠入2%的無菌CaCl2溶液中，固化30min成膜。用3.5% CaCl2溶液浸泡10min進行硬化。過濾取得樣品，用清水漂去表面的CaCl2殘液，再用質量分數為0.85%的無菌生理鹽水洗滌微膠囊表面菌體。在-40℃的超低溫冰箱中預凍4h以上，再在冷凍干燥機中進行凍干處理24h，使其水分含量小于3%，制得微膠囊。

1.3.3 包裝及保藏

將凍干后的微膠囊進行真空包裝，在4℃冰箱中保藏。

1.3.4 單因素試驗

表1 單因素試驗因素水平表Table1 Factors and levels for one-factor-at-a-time design

1.3.5 正交試驗

選擇多孔淀粉用量、溫度、pH值、振蕩時間4個因素設置3個水平，安排L9(34)正交試驗。

1.3.6 微膠囊包埋率的測定

取冷凍干燥后的樣品0.1g于10mL磷酸緩沖液中破壁，從中吸取1mL稀釋濃度梯度，然后涂布平板，(37±1)℃恒溫厭氧培養24h，活菌計數依據GB 4789.35—2010《食品微生物學檢驗：乳酸菌檢驗》標準進行。取適量檢樣(微膠囊)，用生理鹽水進行適當倍數稀釋后選擇2～3個試樣，各取1mL在無菌環境下注入MRS固體培養基中。

式中：T為樣品內的活菌接種量/(CFU/mL)；W為包埋原液中的活菌接種量/(CFU/mL)。

1.3.7 飼喂實驗

選取身體狀況良好的幼犬13只，每天對其定量飼喂3次所制得的嗜酸乳桿菌微膠囊，收集其糞便，并分別檢測雙歧桿菌、乳酸菌、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌的數量變化。

1.3.8 益生作用效果評價[17-22]

將每批次的樣品按序號取出，記錄名稱，然后準確稱取樣品5.00g，分別轉移至盛有45mL生理鹽水、45mL蛋白胨水的錐形瓶中，振搖2min，靜置，備用。

分別采用GB/T 4789.3—2003《食品衛生微生物學檢驗：大腸菌群測定》檢測大腸桿菌，GB/T 4789.34—2008《食品衛生微生物學檢驗：雙歧桿菌檢驗》檢測雙歧乳桿菌，SN/T 1941.1—2007《進出口食品中乳酸菌檢驗方法》檢測乳酸菌，GB/T 4789.13—2003《食品衛生微生物學檢驗：產氣莢膜梭菌檢驗》檢測產氣莢膜桿菌。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 多孔淀粉用量對微膠囊化的影響由表2可知，在pH值、包埋溫度及振蕩時間不變的條件下，當多孔淀粉用量在4g時，微膠囊的包埋效果最好。此時理論上微膠囊的粒徑分布范圍較窄，呈球性較好。多孔淀粉顆粒的孔洞對嗜酸乳桿菌有一定的容納數量(即飽和度)，當達到該飽和度時，多孔淀粉添加量的增加不會引起包埋率的增加。且多孔淀粉添加量的增加(＞

表2 多孔淀粉用量對微膠囊化的影響Table2 Effect of porous starch mass on embedment efficiency

4g)會造成微膠囊的團聚，難以分離、收集。因此，選擇多孔淀粉添加量為4g為宜。

2.1.2 溫度對微膠囊化的影響

表3 溫度對微膠囊化的影響Table3 Effect of temperature on embedment efficiencyTab

由表3可知，在其他參數不變的條件下，隨著包埋溫度的升高，包埋率隨之降低，在溫度為20℃時包埋效率為最高。

2.1.3 振蕩時間對微膠囊化的影響

表4 振蕩時間對微膠囊化的影響Table4 Effect of oscillation time on embedment efficiency

由表4可知，微膠囊包埋率隨著振蕩時間的延長而升高。當振蕩時間在50min時，多孔淀粉就能充分包埋菌種，包埋效率最好。在整個試驗過程中，由于溶液中的菌體先到達多孔淀粉顆粒周圍，再通過吸附力進入顆粒內部的孔洞中，振蕩時間逐漸延長時增大了顆粒與菌體充分接觸的幾率，從而包埋率逐漸提高。振蕩時間大于50min后多孔淀粉慢慢開始崩解，故以振蕩時間50min為好。

2.1.4 pH值對微膠囊化的影響

表5 pH值對微膠囊化的影響Table5 Effect of pH on embedment efficiency

由表5可知，微膠囊的包埋率隨著pH值的變化而變化。由于多孔淀粉對pH值較穩定，嗜酸乳桿菌在pH5.5～6.0范圍內也能保持較好的活性，所以當pH值為6.0時，包埋效率較高，粒徑分布范圍較窄，利于收集；而在pH值小于6.0時，由于包埋條件不佳，微膠囊的粒徑大且呈球性不好，不利于收集；當pH值大于6.0時，微膠囊包埋率下降。

2.2 正交試驗

表6 L6 L9(3(34)正交試驗設計及結果Table6 Orthogonal array design matrix and results

由表6可知，各因素影響微膠囊化的主次順序為多孔淀粉用量＞包埋溫度＞振蕩時間＞pH值。包埋過程中，溶液中的嗜酸乳桿菌菌體先到達多孔淀粉顆粒周圍，再通過吸附力進入顆粒內部的孔洞中，當振蕩轉速過大或過小時會降低顆粒與菌體接觸的幾率，從而影響包埋率；而多孔淀粉對pH值較穩定，嗜酸乳桿菌在pH5.5～6.0范圍內也能保持較好的活性，包埋過程受溶液pH值的影響較小。

根據正交試驗結果可知，嗜酸乳桿菌微膠囊化的最佳工藝條件為A2B2C3D1，即多孔淀粉用量5g、振蕩時間50min、包埋pH6.0、包埋溫度20℃，按此工藝條件進行驗證實驗測得包埋率為67.12%。

表7 正交試驗方差分析表Table7 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

方差分析進一步表明在影響微膠囊化包埋率的因素中，多孔淀粉用量為顯著性因素，pH值、振蕩時間、包埋溫度對微膠囊化有一定的影響。

2.3 益生作用效果評價

表8 犬糞便中雙歧桿菌的測定結果Table8 Effect of ingestion of Lactobacillus acidophilus microcapsules on Bififi dobacterium population in dog feces個/g

由表8可知，隨著飼喂量的增加，犬糞便中的雙歧桿菌檢出量也不斷增加，很快上升了兩個數量級。嗜酸乳桿菌是腸道中的主要益生菌和雙歧桿菌是互生關系，由于喂養了嗜酸乳桿菌微膠囊，實驗犬腸道中的嗜酸乳桿菌數量比例得到了提升，其分泌的抗生物類物質抑制了致病菌的生長，為雙歧桿菌的生長提供了有利條件，使雙歧桿菌數量上升，共同調節腸道菌群平衡。

表9 犬糞便中乳酸菌的測定結果Table9 Effect of ingestion of Lactobacillus acidophilus microcapsules on Lactobacillus population in dog feces個/g

由表9可知，隨著飼喂量的增加，試驗犬糞便中乳酸菌的數量迅速上升，在后期雖有一定的平緩下降，但仍處于同一個數量級，屬于正常的波動情況。嗜酸乳桿菌屬于乳酸菌的一個屬，與其他的很多乳酸菌均存在互生關系，它們在腸道內共同發酵，能更好地抑制有害菌的生長，有利于益生菌在胃腸道占據優勢(80%以上)，維持機體處于健康狀態。

表10 犬糞便中大腸桿菌的測定結果Table10 Effect of ingestion of Lactobacillus acidophilus microcapsulleess oonn Escherichia coollii population in dog feceess個/100g

由表10可知，隨著飼喂量的增加，實驗犬糞便中的大腸桿菌數量急劇下降，降低到40個/100g左右時，呈緩慢下降趨勢，變化不大，這是由于嗜酸乳桿菌能分泌抗生物素類物質(嗜酸乳菌素、嗜酸桿菌素、乳酸菌素)， 對腸道致病菌產生拮抗作用。大腸桿菌腸道致病菌，具有毒力因子(如內毒素、莢膜、黏附素、外毒素等)，在一些特殊條件下，會危害身體健康。大腸桿菌在腸道中比例的下降，標志著飼喂狗的嗜酸乳桿菌微膠囊進入腸道后成功定植于其胃腸道并對腸道菌群起到了很好的調節效果。

表11 犬糞便中產氣莢膜梭菌的測定結果Table11 Effect of ingestion of Lactobacillus acidophilus microcapsules on Clostridium perfringens population in dog feces個/g

由表11可知，隨著飼喂量的增加，狗糞便中產氣莢膜桿菌的數量快速下降。產氣莢膜桿菌是寄居在溫血動物消化道內，能引起多種致病。由于嗜酸乳桿菌等其他的胃腸道益生菌對其拮抗作用的結果，產氣莢膜桿菌在腸道中比例的下降，標志著飼喂狗的嗜酸乳桿菌微膠囊進入腸道后成功定植于其胃腸道并對腸道菌群起到了很好的調節效果。

表12 犬糞便中pH值的測定結果Table12 Effect of ingestion of Lactobacillus acidophilus microcapsules on fecal pH of dogs

由表12可知，隨著飼喂量的增加，犬糞便的pH值幾乎沒有改變，說明實驗犬的身體狀況很穩定，沒有產生很大的波動變化。嗜酸乳桿菌微膠囊對腸道菌群的平衡調節效果很好，抵抗了一些致病菌導致機體代謝的紊亂，pH值變化幅度大的不穩定情況。

3 結 論

在pH6.0、多孔淀粉添加量5g、溫度20℃、振速200r/min振蕩50min條件下制備的嗜酸乳桿菌微膠囊的包埋率為67.12%；經喂養幼犬后，實驗犬腸道的大腸桿菌、產氣莢膜桿菌數量得到很好的控制，雙歧桿菌、乳酸菌等腸道益生菌菌群占據優勢，幫助機體提高免疫力、消化吸收功能等，維持機體生理狀況的穩定平衡。

[1] 趙瑞香. 嗜酸乳桿菌及其應用研究[M]. 北京: 科學出版社, 2007.

[2] 劉齊, 盧娜. 嗜酸乳桿菌的研究現狀與趨勢[J]. 科技創業月刊, 2009(12): 79-80.

[3] LI Xiaoyan, CHEN Xiguang, SUN Zhongwu, et al. Preparation of alginate/chitosan/carboxymethyl chitosan complex microcapsules and application in Lactobacillus casei ATCC 393[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 83(4): 1479-1485.

[4] 張兆俊. 微孔淀粉包埋乳酸菌功能性研究[D]. 重慶: 西南大學, 2006.

[5] 莊海寧, 金征宇. 微孔淀粉在食品微膠囊化中的應用[J]. 食品與機械, 2007(2): 129-130.

[6] 姚衛蓉, 姚惠源. 多孔淀粉包埋益生菌的工藝研究[J]. 廣州食品工業科技, 2004(B11): 31-33.

[7] 王學佩, 劉霞, 王金玲. 多孔淀粉在乳酸菌微膠囊制劑上的開發與利用[C]//中國畜牧獸醫學會動物微生態學分會第四屆第九次學術研討會論文集. 北京: 國家食品藥品監督管理局, 2008: 70-78.

[8] 孫欣. 吸附與包埋技術固定化乳酸菌及其性質研究[D]. 青島: 中國海洋大學, 2007.

[9] 馮瓊, 李保國, 黃志強, 等. 微膠囊技術在益生菌中的應用[J]. 食品科技, 2007(10): 230-235.

[10] REN Zhihua, PAN Cuiling, JIANG Luyan, et al. Oxalate-degrading capacities of lactic acid bacteria in canine feces[J]. Veterinary Microbiology, 2011, 152(3/4): 368-373.

[11] 郭佳, 陳琳, 張柏林. 膳食纖維微膠囊化包埋益生菌的研究[J]. 乳業科學與技術, 2008, 31(5): 201-206.

[12] 韓迪. 影響益生菌存活率因素的研究[D]. 西安: 陜西科技大學, 2007.

[13] SEMYONOV D, RAMON O, KAPLUN Z, et al. Microencapsulation of Lactobacillus paracasei by spray freeze drying[J]. Food Research International, 2010, 143: 193-202.

[14] MINNA R, KATRI J, ELIAS W, et al. Interaction between probiotic lactic acid bacteria and canine enteric pathogens: a risk factor for intestinal Enterococcus faecium colonization?[J]. Veterinary Microbiology, 2003, 92(1/2): 111-119.

[15] 王菡, 代海兵, 桂藝方. 嗜酸乳桿菌凍干菌粉制備[J]. 牡丹江醫學院學報, 2012, 33(1): 16-18.

[16] 國家加工食品質量監督檢驗中心(廣州). GB/T 4789.35—2010食品衛生微生物學檢驗標準[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[17] 聶實踐. 飼用微生態制劑調節動物腸道菌群研究及應用[C]//中國畜牧獸醫學會小動物醫學分會成立大會暨學術報告會. 北京: 中國畜牧獸醫學會, 2005: 174.

[18] 段永蘭. 益生菌與動物飼料[J]. 鄭州牧業工程高等專科學校學報, 2007(2): 31-32.

[19] 孫鳴, 潘寶海, 陳偉興, 等. 益生菌、益生元及合生素的作用機制和相互關系[J]. 飼料研究, 2008(4): 62-64.

[20] 馬嫄, 王德純, 李慶, 等. 益生菌在寵物食品中的應用[J]. 西華大學學報: 自然科學版, 2011, 30(1): 103-106.

[21] 曾子丹, 姚朔影. 益生菌的研究前景及國內外發展狀況[J]. 食品工業科技, 2007, 28(8): 251-254.

[22] 霍軍, 宋予震, 胡青妞. 犬用微生態制劑對幼犬生長影響的研究[J].鄭州牧業工程高等專科學校學報, 2008, 28(2): 5-7.

Preparation by Double-Layer Embedment and Application of Lactobacillus acidophilus Microcapsules

MA Yuan，DUAN Xian-ping，LIU Yun，GONG Li
(School of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

Lactobacillus acidophilus microcapsules were prepared by means of double-layer embedment using porous starch as wall material to overcome unfavorable conditions such as mechanical compression and gastric acid and promote the probiotic effect of Lactobacillus acidophilus in the gut. Operating parameters such as pH, oscillation time, porous starch dosage and temperature were optimized by one-factor-at-a-time method and orthogonal array design. The embedment efficiency of Lactobacillus acidophilus microcapsules was 67.12% under the optimized conditions of5 g of porous starch, pH 6.0 and oscillation at 200 r/min for 50 min. Ingestion of Lactobacillus acidophilus microcapsules could effectively improve the intestinal microflora as demonstrated by its effect on Bifidobacterium, Lactobacillus, Escherichia coli, Clostridium perfringens and pH in the feces of young dogs.

Lactobacillus acidophilus；microencapsulation；porous starch；embedment

TS20

A

1002-6630(2013)04-0099-05

2012-07-31

教育部“春暉計劃”項目(Z2010104)；食品生物技術四川省重點實驗室項目(SZJJ2011-004)；四川省教育廳重點項目(12ZA157)；食品科學四川省重點學科建設項目(SZD0803-09-1)

馬嫄(1978—)，女，副教授，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：summerpony@yahoo.cn