響應面法優化蘆蒿葉總黃酮的提取工藝

扶慶權，侯 佩，陳 能

(1.南京曉莊學院生物化工與環境工程學院，江蘇 南京 211171；2.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064)

響應面法優化蘆蒿葉總黃酮的提取工藝

扶慶權1，侯 佩2，陳 能1

(1.南京曉莊學院生物化工與環境工程學院，江蘇 南京 211171；2.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064)

以蘆蒿葉為原料提取黃酮類物質。在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法研究提取溫度、乙醇溶液體積分數、料液比和提取時間對蘆蒿葉總黃酮得率的影響，并建立該工藝的二次多項式模型。結果表明：回歸模型具有高度顯著性，可對蘆蒿葉總黃酮得率進行有效分析和合理預測；各因素對得率的影響大小順序依次為提取時間＞乙醇溶液體積分數＞料液比＞提取溫度；有機溶劑回流提取蘆蒿葉總黃酮的最佳工藝條件為乙醇溶液體積分數70%、提取溫度80℃、料液比1:100(g/mL)、提取時間180min，在此條件下總黃酮得率為6.58%。

蘆蒿；總黃酮；提取工藝；響應曲面法

蘆蒿，又名萎蒿、藜蒿、水蒿、狹葉蒿、柳蒿等，為多年生菊科蒿屬草本植物，原產于亞洲，主要分布于我國長江中下游地區及東北、華北和中南地區。蘆蒿富含氨基酸，且谷氨酸占總氨基酸含量的24.42%[1]，含有的測柏蓮酮芳香油具有獨特風味，此外，微量元素硒的含量是蘆薈的10倍[2]。蘆蒿葉類黃酮是蘆蒿葉中最重要的生物活性物質之一，類黃酮作為天然的抗氧化劑具有抗腫瘤、延緩衰老、降血糖、降血脂、抗氧化、消除體內自由基、增強免疫力、抗菌、抗病毒及保護心腦血管等多種功效[3-11]。我國蘆蒿資源十分豐富，僅南京市八卦洲現有蘆蒿種植面積2.2×102km2，年產蘆蒿3萬t[12]。若將蘆蒿葉充分利用來提取黃酮類物質，既可以增加蘆蒿產業的附加值，又可以保護環境，具有較好的經濟意義和價值。本實驗通過響應曲面試驗優化蘆蒿葉中總黃酮的提取工藝條件，為提高蘆蒿葉的利用率和工業化生產高附加值的總黃酮提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆蒿葉采摘自南京江心洲蘆蒿種植基地，采摘后曬干粉碎備用。

蘆丁標準品 中國食品藥品檢定研究院；氫氧化鈉、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁等(均為分析純) 南京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

7230G型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；AUY120型電子天平 日本島津公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；TDL-型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；SHB-III 型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取液制備

取蘆蒿葉粉末2.0000g，按預先設計好的實驗方案用一定體積分數和體積的乙醇溶液于一定溫度回流提取一定時間，提取液趁熱抽濾，濾渣棄去，收集濾液并精量其體積，記錄數據。總黃酮含量的測定：精密移取2.00mL離心后的提取液置于25mL容量瓶中，按標準曲線的測定方法測定吸光度后，計算得樣品的總黃酮含量。

1.3.2 蘆丁標準曲線制作

精密稱取于105℃條件下干燥至質量恒定的蘆丁標準品10mg，用體積分數為70%的乙醇溶液溶解，定容至100mL，搖勻，得到0.1mg/mL的蘆丁標準溶液，備用。分別準確吸取蘆丁標準溶液0.00、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50、15.00mL于25mL的容量瓶中。先加入5%亞硝酸鈉1.00mL，搖勻，放置6min；再加入10%硝酸鋁溶液1.00mL，搖勻，放置6min；最后加入1.0mol/L 氫氧化鈉溶液5.00mL，用體積分數為70%的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置10min。用空白液作參比，用分光光度計測定510nm處的吸光度。所得標準曲線為蘆丁濃度C和吸光度A的關系，根據所得數據，得到線性回歸方程為：A=8.0286×C-0.0006，R2=0.9948。

得率/%

式中：C為測量液總黃酮質量濃度/(mg/mL)；V為粗提液體積/mL；N為稀釋倍數；m為原料質量/g。

1.3.4 單因素試驗

以乙醇溶液為提取溶劑，固定乙醇溶液體積分數70%、提取溫度70℃、料液比1:60、提取時間90min，分別考察不同體積分數的乙醇溶液、提取溫度、料液比和提取時間進行單因素試驗，按照制作標準曲線的方法測定總黃酮，計算得率，研究不同因素對蘆蒿葉總黃酮得率的影響。

1.3.5 響應曲面優化試驗設計

表1 響應面試驗因素與水平設計Table1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.6 數據統計與分析

利用SAS 8.0對數據進行處理和分析，并采用Design-Expert 7.0 軟件對響應面試驗得到的數據進行線性回歸和方差分析，通過F值考察(P＜0.05)模型及因素的顯著性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇溶液體積分數對蘆蒿葉總黃酮得率的影響

圖1 乙醇溶液體積分數對蘆蒿葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

如圖1所示，蘆蒿葉總黃酮得率隨乙醇溶液體積分數的增大而提高，當乙醇溶液體積分數達到70%時得率達到最大值，此后隨著乙醇溶液體積分數的增大得率開始降低，這可能是由于乙醇溶液體積分數過大，溶液沸點開始降低(乙醇沸點79℃)，導致揮發性過大，同時一些醇溶性的其他物質大量溶出，從而導致黃酮類物質得率降低。因此，最佳乙醇溶液體積分數為70%。

2.1.2 提取溫度對蘆蒿葉總黃酮得率的影響

圖2 提取溫度對蘆蒿葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of temperature on the extraction yield of total flavonoidsres

如圖2所示，蘆蒿葉總黃酮得率隨提取溫度的升高迅速提高，當溫度達到70℃時，總黃酮得率達到最大值，此后隨著溫度的增加總黃酮得率開始下降，這可能是由于起初總黃酮物質隨著溫度的升高不斷溶出，后來由于溫度過高，總黃酮物質受到一定程度的破壞，從而得率下降。因此，最佳提取溫度為70℃。

2.1.3 料液比對蘆蒿葉總黃酮得率的影響

圖3 料液比對蘆蒿葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids

如圖3所示，蘆蒿葉總黃酮得率隨著料液比的增大而迅速提高，當料液比大于1:80時總黃酮得率提高趨勢開始減緩。這可能是由于溶劑量過大時，完全提取總黃酮所需要的時間較長，導致提取不完全。因此，考慮到實際情況節約成本，最佳料液比選為1:80。

2.1.4 提取時間對蘆蒿葉總黃酮得率的影響

圖4 提取時間對蘆蒿葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of time on the extraction yield of total flavonoids

如圖4所示，隨著提取時間的延長，蘆蒿葉總黃酮得率迅速提高，當提取時間超過150min時總黃酮得率有所下降。這可能是由于長時間高溫處理導致乙醇溶液體積分數減小，從而導致總黃酮得率下降。因此，最佳提取時間為150min。

2.2 響應曲面優化試驗

2.2.1 二次響應面回歸模型的建立與分析

響應面試驗設計與結果見表2。應用Design Expert進行多元回歸擬合分析，可得到提取條件與總黃酮得率之間的二次多項式模型為：Y=5.54-0.027X1＋0.073X2＋ 0.073X3＋0.11X4-0.23X1X2＋0.29X1X3＋0.25X1X4＋0.43X2X3-0.035X2X4＋0.15X3X4-0.0069 X12＋0.063X22＋0.099X32＋0.47X42。

由表3可知，回歸模型具有高度的顯著性(P＜0.0001)，失擬項具有不顯著性(P=0.8308＞0.05)，R2=0.9909，R2Adj=0.9819，X2、X3、X4均達到極顯著水平(P＜0.001)，表明此模型對試驗擬合度好，可以對總黃酮得率進行很好的分析和預測。由表3還可以看出，因素X1X2、X1X3、對蘆蒿葉總黃酮得率有極其顯著的影響(P＜0.01)；因素X1、X2X4、X12對蘆蒿葉總黃酮得率影響不顯著(P＞0.05)。

表2 響應面試驗設計與結果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 響應面二次模型的方差分析Table3 ANOVA for the fitted regression model

由F值可知，各因素對蘆蒿葉總黃酮得率的影響主次順序依次為提取時間＞乙醇溶液體積分數＞料液比＞提取溫度。

2.2.2 兩因素間的交互作用分析

圖5 各兩因素交互作用對蘆蒿葉總黃酮得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of operating parameters on the extraction yield of total flavonoids

由圖5a可知，當乙醇溶液體積分數一定時，隨著提取溫度的升高，總黃酮得率不斷提高；當提取溫度在70～75℃范圍時，隨著乙醇溶液體積分數的增大，總黃酮得率隨之提高。當提取溫度在75～80℃范圍時，隨著乙醇溶液體積分數的增大，總黃酮得率先降低后提高。

由圖5b可知，當料液比在1:95～1:100范圍時，隨著提取溫度的升高，總黃酮得率不斷減小；當料液比在1:95～1:105范圍時，隨著提取溫度的升高，總黃酮得率不斷提高；當提取溫度在70～75℃時，隨著料液比的增大，總黃酮得率不斷降低；當提取溫度在75～80℃時，隨著料液比的增大，總黃酮得率不斷提高。

由圖5c可知，當提取時間一定時，隨著提取溫度的升高，總黃酮得率不斷降低；當提取溫度一定時，隨著提取時間的延長，總黃酮得率先降低后提高。

由圖5d可知，當料液比在1:95～1:100范圍時，隨著乙醇溶液體積分數的增加，總黃酮得率降低；當料液比在1:100～1:105范圍時，隨著乙醇溶液體積分數的增大，總黃酮得率隨之提高；當乙醇溶液體積分數在65%～70%范圍時，隨著料液比的增大，總黃酮得率降低；當乙醇溶液體積分數在70%～75%范圍時，隨著料液比的增大，總黃酮得率隨之提高。

由圖5e可知，當提取時間一定時，隨著乙醇溶液體積分數的增大，總黃酮得率隨之提高；當乙醇溶液體積分數一定時，隨著提取時間的延長，總黃酮得率先降低后提高。

由圖5f可知，當提取時間一定時，隨著料液比的增大，總黃酮得率不斷提高；當料液比一定時，隨著提取時間的延長，總黃酮得率先降低后提高。

2.2.3 最佳工藝條件的預測和檢驗

通過二次多項回歸的預測，得到有機溶劑回流提取蘆蒿葉總黃酮的最佳條件為乙醇溶液體積分數71.11%、提取溫度78.63℃、料液比1:104.14(g/mL)、提取時間178.63min。在此條件下，蘆蒿葉總黃酮得率預測值為6.70%。考慮實際操作過程的方便性，將提取工藝參數修正為乙醇溶液體積分數70%、提取溫度80℃、提取時間180min、料液比1:100(g/mL)，實際測定的總黃酮得率為6.58%。因此，建立的模型與實際情況基本吻合。

3 結 論

采用有機溶劑回流提取蘆蒿葉中總黃酮，通過單因素試驗和響應曲面分析優化提取蘆蒿葉總黃酮的最佳工藝條件為乙醇溶液體積分數70%、提取溫度80℃、料液比1:100(g/mL)、提取時間180min，在以上最佳條件下實際測定的總黃酮得率可達到6.58%。同時得到蘆蒿葉總黃酮得率與各提取條件的二次多項式模型，該模型擬合度較好，在實際應用過程中具有一定的實驗參考價值。

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Optimization of Extraction Process for Total Flavonoids from Artemisia selengensis Turcz Leaves by Response Surface Methodology

FU Qing-quan1，HOU Pei2，CHEN Neng1
(1. School of Biochemical and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China；2. College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)

The extraction of total flavonoids from Artemisia selengensis Turcz leaves was optimized by response surface methodology. The effects of temperature, ethanol concentration, solid-to-liquid ratio and extraction time on the extraction yield of total flavonoids were investigated. A quadratic regression model equation that describes the extraction process was fitted. The results showed that the fitted regression model had high statistical significance and good prediction capability. Four extraction parameters were ranked in descending order of their effect on the extraction yield of total flavonoids as follows: time ＞ ethanol concentration ＞ solid-to-liquid ratio (g/mL) ＞ temperature. The optimal conditions for ethanol reflux extraction of total flavonoids were found to be 70% ethanol, 80 ℃, a solid-to-liquid ratio of 1:100 (g/mL) and 180 min. Under the optimized conditions, the extraction yield of total flavonoids was 6.58%.

Artemisia selengensis Turcz；total flavonoids；extraction process；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2013)04-0094-05

2012-05-14

南京曉莊學院校級應用型研究課題項目(2011NXY06)

扶慶權(1975—)，男，工程師，博士研究生，研究方向為生物活性物質及食品添加劑應用。E-mail：fuqingquan@126.com