逆流色譜與硅膠柱色譜相結合分離純化高良姜中高良姜素

徐 靜，曹學麗,*，尹 鷺，成 超，王 尉，樂勝峰，周曉晶

(1.北京工商大學食品學院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.北京理化分析測試中心，北京 100089)

逆流色譜與硅膠柱色譜相結合分離純化高良姜中高良姜素

徐 靜1，曹學麗1,*，尹 鷺1，成 超1，王 尉2，樂勝峰2，周曉晶2

(1.北京工商大學食品學院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.北京理化分析測試中心，北京 100089)

目的：建立一種從高良姜粗提物中分離制備高純度高良姜素的方法。方法：采用逆流色譜(CCC)直接法以及逆流色譜(CCC)與硅膠柱色譜相結合兩種方法從高良姜粗提物中分離制備高良姜素。結果：先用硅膠柱色譜對粗提物進行預分離，然后采用逆流色譜，以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(2:0.4:0.8:0.9，V/V)為兩相溶劑體系，對目標組分進行純化，可以從高良姜粗提物中制備得到高純度高良姜素。通過該方法可以從3.5g高良姜粗提物中分離得到純度為99.1%的高良姜素15.6mg，純度為95.2%的未知化合物Ⅱ5.2mg。結論：硅膠柱色譜與逆流色譜相結合為一種分離制備高純度高良姜素有效方法。該方法可用于相關標準樣品的研制及功能因子的開發。

高良姜；高良姜素；逆流色譜；硅膠柱色譜

高良姜(Alpinia officinarum Hance)為姜科山姜屬植物[1]，別名小良姜，是一種藥食同源的植物。氣香，味辛辣，具有溫胃、散寒、行氣、止痛的作用，可用于脘腹冷痛，胃寒嘔吐等病癥。高良姜中主要含有二苯基庚烷類、揮發油、黃酮類化合物，以及糖苷、苯丙素、甾醇類化合物等[2-3]。研究表明其黃酮類成分具有抗氧化的作用，可以作為藥食兩用的植物使用[4]。而且高良姜的煎劑或浸泡提取物，還可用于對柑橘、蘋果、草莓、食用菌等果蔬的保鮮[5]，作為一種天然的食品保鮮劑越來越受到人們的關注。高良姜素(galangin，3,5,7-三羥基黃酮)是高良姜中一種主要的黃酮類的成分(圖1)，對高良姜的鑒別具有很強的專屬性。在現代藥理學的研究中發現高良姜素有抗腫瘤、抗病毒、抗細菌、抗炎、抗氧化等多種生物活性[6]，已成為國內醫藥界研究與開發的熱點。因此，建立高良姜素的高效分離純化方法具有重要意義。

圖1 高良姜素的化學結構Fig.1 Chemical structure of galangin

目前從高良姜中分離純化高良姜素的主要方法是溶劑提取結合反復的常規柱層析[7-9]，分離步驟繁雜，分離效率低，所得產品需反復重結晶。且由于固體介質的不可逆吸附作用，造成樣品組分的損失較大，回收率較低。逆流色譜(counter-current chromatography，CCC) 是一種連續高效的液-液分配色譜分離技術，由于不需要任何的固體分離介質，物質之間依據在兩相不相溶的溶劑體系中分配系數的不同而實現分離[10]。它具有分離效率高、制備量大、操作簡單等特點，且由于不存在分離介質的不可逆吸附，因此具有回收率高的優點，近年來廣泛應用于天然活性成分的分離與制備[11-12]。但是目前還未見有采用逆流色譜分離純化高良姜素的報道。本實驗建立了一種逆流色譜與硅膠柱色譜相結合從高良姜粗提物種分離制備高純度的高良姜素的有效方法，可為高良姜藥效物質的基礎研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高良姜中藥 北京市白塔寺藥店；高良姜素對照品南京澤朗植提技術有限公司。

乙醇、石油醚等用于樣品提取及逆流色譜分離的試劑(均為分析純) 北京化學試劑公司；甲醇(色譜純)美國Fisher公司；冰乙酸(色譜純) 天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

TBE-300A半制備型高速逆流色譜儀(配有220mL半制備柱、Tauto TBP 5002輸液泵及TBD-23 UV雙波長檢測器) 上海同田生化技術有限公司；Spectrum高效逆流色譜儀(配有133.5mL半制備柱、Knauer Smartline 1000輸液泵及UV 2500可變波長檢測器) 英國Dynamic Extraction公司；RE-2000型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；ALPHA 2-4 LSC型冷凍干燥機 德國Christ公司；1100高效液相色譜儀(配有四元梯度泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器等)、1100 MSD Trap質譜儀(電噴霧電離(electrospray ionization，ESI) 美國Agilent公司；Avance 600核磁共振波譜儀 瑞士Bruker公司。

1.3 高良姜粗提物的制備

高良姜藥材經粉碎后，過60目篩。將樣品以1:10的質量比用85%乙醇溶液超聲提取3次，每次40min，合并提取液，減壓濃縮至浸膏，真空干燥后得褐色粉末，置于冰箱(4℃)中備用。

1.4 高效液相HPLC分析

通過參考相關文獻[13-14]，經優化后采用如下條件對高良姜粗提物及其分離級分進行分析。液相色譜柱：Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：A(甲醇)，B (0.1%甲酸溶液)；0～35min，50% A梯度洗脫至75% A；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：280、266nm。

1.5 逆流色譜分離

將所選擇的溶劑體系以一定體積比配制于分液漏斗中，充分混合后，靜置過夜。使用前將兩相分離，以上相為固定相，下相為流動相。首先將上相固定相以較快的流速注滿逆流色譜儀螺旋管柱，再使其以一定的轉速旋轉，同時以一定的流速泵入下相流動相。待檢測器出口有下流出，且上相不再增加時，系統達到動力學平衡。將待分離樣品用下相以一定的濃度溶解，進樣，保持流動相流速不變進行洗脫，并開啟色譜工作站采集數據。根據儀器出峰情況分別收集各流出級分。本實驗用到兩種逆流色譜儀，其操作條件分別如表1所示。

表1 逆流色譜儀操作條件Table1 Operating conditions for CCC separation of galangin

1.6 硅膠柱色譜粗分離

實驗中發現直接用逆流色譜分離高良姜粗提物，高良姜素一直受到一個雜質的干擾，因此實驗采用硅膠柱對粗提取進行預分離，再用逆流色譜分離的方法。稱取70g硅膠(100～200目)，用氯仿-甲醇(99:1，V/V)混勻后裝柱(60cm，2.2cm)，以5%的上樣比將3.5g粗提物用5mL的氯仿-甲醇(99:1)溶解后上樣，以氯仿-甲醇(99:1、49:1、19:1、9:1、4:1，V/V)依次梯度洗脫，每個梯度洗脫2個柱體積，分別收集各洗脫餾分。餾分經HPLC檢測后，將含有目標物質的餾分合并，濃縮，再用逆流色譜進行純化。

1.7 目標物質結構鑒定

結構鑒定采用電噴霧電離(electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS)、核磁共振氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR)進行。ESI-MS條件：霧化器壓力：50psi；干燥氣體流量：10L/min；干燥器溫度：350℃；掃描范圍：50～2200m/z。

2 結果與分析

2.1 高良姜粗提物的HPLC分析

高良姜粗提物的HPLC分析譜圖如圖2所示。經過與高良姜素對照品比對，初步確定目標物質的出峰位置，如圖2中Ⅰ所示，圖中Ⅱ和Ⅲ為粗提物中與目標物質極性相近的未知干擾物。

圖2 高良姜粗提物的HPLC分析譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of crude galangin extract from A. offi cinarum

2.2 高速逆流色譜法直接從粗提物中分離純化高良姜素

圖3 高良姜粗提物的CCC分離譜圖Fig.3 CCC chromatogram of crude galangin extract from A. offi cinarum

根據高良姜素的結構及其在HPLC圖中的出峰位置，可知其為中等極性化合物，采用Ito等[15]、Oka等[16]的溶劑系統篩選方法，選擇基于正已烷-乙酸乙酯-甲醇-水的中等極性溶劑體系。通過測定不同溶劑配比下高良姜素的分配系數，并用石油醚代替價格較貴的正己烷，最終確定溶劑體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:0.4:0.8:0.9，V/V)。采用該溶劑體系，及表1中TBE-300A高速逆流色譜儀分離條件，對高良姜素粗提物直接進行CCC分離，如圖3A所示。進一步調整溶劑體系，將其中的甲醇更換為乙醇，所得分離譜圖如圖3B所示。可見經優化后，分離時間縮短約150min，1#和2#組分的分離度保持不變。

分別收集1#和2#組分，經HPLC分析顯示，1#組分為圖2中所示的未知化合物Ⅱ，純度為95.1%(圖4A)。2#主要為目標物高良姜素，純度為85.6% (圖4B)，其中含有少量的化合物Ⅲ。

可見采用逆流色譜法直接從高良姜粗提物中一步分離高良姜素，可以將其純度從39.2%提高到85.6%，但少量的化合物Ⅲ經多次實驗均不能很好分離。因此，后續采用硅膠柱色譜預分離配合逆流色譜純化的方法。

圖4 高良姜粗提物的逆流色譜分離組分的HPLC分析譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of CCC peak fractions of crude galangin extract from A. offi cinarum

2.3 硅膠柱預分離與逆流色譜結合分離純化高良姜素

圖5 硅膠柱預分離所得目標物質餾分的HPLC分析譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of galangin separated by silica gel chromatography

采用硅膠柱預分離，分別收集氯仿-甲醇梯度洗脫餾分，進行HPLC分析。結果表明，氯仿-甲醇(19:1、9:1，V/V)洗脫餾分中主要含有目標物質化合物Ⅰ高良姜素，同時含有干擾物Ⅱ，但是之前難以與高良姜素Ⅰ分離的干擾物Ⅲ得到了分離，如圖5所示。而采用之前的逆流色譜法很容易將高良姜素Ⅰ與化合物Ⅱ分離。因此，將兩個洗脫餾分合并濃縮，真空冷凍干燥，從3.5g粗提物中共得到預分離目標級分180mg。采用前面逆流色譜溶劑體系用Spectrum高效逆流色譜儀對其進行進一步分離，如圖6所示，得到15.6mg高純度目標物Ⅰ高良姜素(2#)，同時得到了5.2mg化合物Ⅱ(1#)。HPLC分析顯示，目標物Ⅰ高良姜素的純度為99.1%，如圖7所示。

圖6 硅膠柱預分離所得目標物質餾分的CCC分離譜圖Fig.6 CCC chromatogram of galangin separated by silica gel chromatography

圖7 最終分離純化所得高良姜素的HPLC分析譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of purified galangin

2.4 分離所得高良姜素的結構確認

圖8 分離所得高良姜素的正-負離子模式的質譜圖Fig.8 MS spectra of purified galangin under positive and negative modes

分離所得高純度高良姜素經ESI-MS正負離子模式分析，所得質譜圖如圖8所示。

圖8中ESI-MS正負離子模式下分別顯示m/z 271.1[M+H]+和m/z 269.0[M-H]-，與高良姜素相對分子質量270吻合。核磁共振數據歸屬如下，1H-NMR(600MHz，DMSO-d6)：δH：12.37(1H, s, 5-OH)、 10.87(1H, s, 7-OH)、 9.68(1H, s, 7-OH)、8.17(2H, d, J=7.2Hz, H-2’, 6’)、7.53(1H, dd, J=7.2Hz, 6.6Hz, H-3’, 4’, 5’)、6.48(1H, s, H-8)、6.42(1H, s, H-2)；13C-NMR(150Hz, DMSO-d6)：δC：176.7 (C-4)、164.7(C-7)、161.2(C-5)、156.8(C-9)、146.2(C-2)、137.5(C-3)、131.4(C-1’)、130.4(C-4’)、128.9(C-2’, 6’)、128.0(C-3’, 5’)、103.7(C-10)、98.8(C-6)、94.0(C-8)。其1H-NMR和13C-NMR數據與文獻[17]一致，推斷分子式為C15H10O5，最終確認分離所得物為高良姜素(galangin)。

3 討論與結論

本實驗研究了兩種從高良姜粗提物中分離制備高良姜素的方法，一種是逆流色譜直接法，一種是逆流色譜與硅膠柱預分離相結合的方法。結果表明，高良姜粗提物中存在兩種干擾目標物Ⅰ高良姜素的雜質化合物Ⅱ和Ⅲ。采用逆流色譜法直接分離，可以將高良姜素與干擾物Ⅱ實現分離，但是干擾物Ⅲ始終與高良姜素共存，很難去除；采用硅膠柱層析，可以先將粗提取中的干擾物Ⅲ分離，所得高良姜素與干擾物Ⅱ的級分再經逆流色譜純化，即可得到高純度的高良姜素單體。本研究，一方面表明逆流色譜在天然活性成分分離純化方面的優勢；另一方面也表明逆流色譜與傳統柱層析相結合在一定條件下可以起到互補的獨特分離效果。本實驗所建立的高純度高良姜素的分離制備方法可用于相關標準樣品的研制及功能因子的開發。

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Separation and Purification of Galangin from Rhizomes of Alpinia offi cinarum Hance by Counter-Current Chromatography Combined with Silica Gel Column Chromatography

XU Jing1，CAO Xue-li1,*，YIN Lu1，CHENG Chao1，WANG Wei2，YUE Sheng-feng2，ZHOU Xiao-jing2
(1. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China)

The objective of this work was to establish a method to separate and purify galangin from rhizomes of Alpinia offi cinarum Hance using silica gel column chromatography combined with counter-current chromatography (CCC). Crude galangin was separated by silica gel column chromatography and further purified by CCC using a two-phase solvent system consisting of petroleum ether, ethyl acetate, ethanol and water (2:0.4:0.8:0.9, V/V). Using the developed method, 15.6 mg of galangin with a purity of 99.1% and 5.2 mg of an unknown compound with a purity of 95.2% were obtained from 3.5 g of crude galangin. This study demonstrates that the combination of silica gel column chromatography with counter-current chromatography can be an effective method for the separation and purification of galangin.

Alpinia offi cinarum；galangin；counter-current chromatography (CCC)；silica gel chromatography

TR914.1

A

1002-6630(2013)04-0055-04

2012-09-29

北京市教委學科建設與研究生培養項目(PXM2012)

徐靜(1987—)，女，碩士，研究方向為生物分離。E-mail：jj_amigo@126.com

*通信作者：曹學麗(1967—)，女，教授，博士，研究方向為生物分離。E-mail：caoxl@th.btbu.edu.cn